Вестерн блот

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до: навігація, пошук
Бенди протеїнів візуалізовані на нітроцелюлозній мембрані при виконанні Вестерн блоту.

Вестерн блот (англ. Western blot) — це широкоросповсюджений лабораторний метод, заснований на реакції антиген-антитіло, що застосовується для визначення специфічних протеїнів в екстрактах клітин або тканин, попередньо фракціонованих за допомогою гелевого електрофорезу та перенесені, в переважній більшості випадків, на нітроцелюлозну або PVDF мембрану. Трансфер протеїнів з гелю на мембрану дозволяє інкубувати їх з певним антитілом та виконати подальшу візуалізацію отриманих бендів.[1]

Історія[ред.ред. код]

Вестерн блот було винайдено Гарі Тоубіном (Harry Towbin), який працював в лабораторії Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research. Проте назва Вестрен Блот була дана цьому методу іншим науковцем — W. Neal Burnette, за аналогією з Саузерн блотом — методом визначення послідовностей в ДНК за допомогою антитіл, що винайшов Едвін Саузерн; та Нозерн блотом — за допомогою якого можна визначити ділянки в РНК, який винайшов Джордж Страк в Стенфорді.

Методика вестерн блоту[ред.ред. код]

Приготування зразків білку[ред.ред. код]

Протоколи виготовлення зразків можуть суттєво відрізнятись в залежності від того, чи є досліджуваний білок інтегральним або розчинним, чи є необхідність у збереженні нативною конформації білка тощо. Зазвичай тканину, з якої необхідно виділити білок, механічно гомогенізують у присутності потужних детергентів, таких як β-меркаптоетанол або Тритон Х-100. Обов'язковим кроком є також вимірювання загальної концентрації білка (за методом Лоурі або Бредфорда) та вирівнювання її в різних зразках шляхом розведення, що полегшує порівняння кінцевих результатів.

Електрофорез[ред.ред. код]

Гелевий електрофорез дозволяє розділити протеїни на фракції, в залежності від їх молекулярної маси — найважчі повільно рухаються, тоді як більш легкі рухаються швидше в гелі.

Трансфер[ред.ред. код]

Наступним етапом вестерн блоту є перенесення білків з електрофорезного гелю на носій, на якому їх можна специфічно помітити антитілами. В якості носія зазвичай використовують мембрану, виготовлену з нітроцелюлози або PVDF. Для проведення трансферу використовується спеціальний пристрій, що має назву трансблотер. В ранніх версіях вестер блоту перенесення білків з гелю на мембрану забезпечувалось фільтрувальним папером, який клався у «сендвіч» з носіїв та тягнув на себе багатий на детергенти трансферний розчин за рахунок капілярних сил. В наш час рушійною силою у процедурі трансферу є електричне поле.

Візуалізація[ред.ред. код]

Нітроцелюлозна та PVDF-мембрани є сильними сорбентами білків, тому перед їх інкубуванням з антитілами проводиться процедура блокування (на лабораторному жаргоні її також часто називають «забивкою») — обробка носія багатим на білок розчином, який зв'яжеться з вільними сайтами на поверхні мембрани і попередить неспецифічну сорбцію антитіл. Зазвичай, в якості білкового розчину використовують знежирене молоко.

Після блокування мембрана інкубується з первинним антитілом, яке специфічно зв'язується з досліджуваним білком. Далі додається вторинне антитіло, мічене біотином, пероксидазою хріна або радіоактивною речовиною, за допомогою якого можна виконати візуалізацію отриманих бендів.

Посилання[ред.ред. код]

  1. Towbin, H. et al. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Bd. 76(9), S. 4350-4354. PMID 388439 PDF