Полімеразна ланцюгова реакція

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.

Перейти до: навігація, пошук
Набір тестових трубочок для ПЛР, кожна трубочка містить 100 μл реагентів реакції.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR) — експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування, для створення генетично модіфікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

Зміст

[ред.] Історія

Карі Мулліс, винахіндик ПЛР

Полімеразна ланцюгова реакція була відкрита Карі Муллісом[1][2]. Він був нагороджений Нобелівською премією з хімії 1993 року за це відкриття, через сім років після того, як він і його колеги з корпорації Cetus запропонували його для практичного використання. Вперше метод був винайден у 1983 році, під час роботи Мулліса в компанії Cetus в місті Емерівіль (Каліфорнія), одній з перших біотехнологічних компаній. Його задачею було створення коротких ланцюжків ДНК для інших учених. Мулліс писав, що ідея ПЛР прийшла йому, коли він вночі в своєму автомобілі їхав уздовж Каліфорнійського шосе 1[1]. Він продумував новий шлях аналізу змін (мутацій) в ДНК, коли усвідомив, що замість цього він винайшов метод ампліфікації будь-якої ділянки ДНК за допомогою повторних циклів дублювання, які б здійснював фермент ДНК-полімераза. В журналі Scientific American Мулліс підвів подсумок метода: «Починаючи з єдиної молекули ДНК, носія генетичної інформації, ПЛР може надати 100 мільярдів подібних молекул за кілька годин. Реакцію дуже легко провести, вона вимагає однієї тестової трубки, незначної кількості реагентів, та джерела тепла»[3].

Фермент ДНК-полімераза зустрічається природно в живих організмах. В живих клітинах він виконує функції реплікації ДНК протягом мітозу та мейозу. Полімераза працює, зв'язуючись з одним ланцюжком ДНК та синтезуючи інший, створюючи подвійну спіраль. У першому прототипі процесу ПЛР, фермент використовувався in vitro (у контролюємому оточенні за межами організму). Дволанцюгова молекула ДНК розділялася на окремі ланцюжки за допомогою нагрівання до 94 °C. При цій температурі, проте, ДНК-полімераза, що використовувалася на той час, гинула, тому фермент доводилося додавати після стадії нагрівання на кожному циклі реакції. Оригінальна процедура була дуже неефективна, тому що вимагала вимагало багато часу, великих кількостей ДНК-полімерази, і безперервної уваги протягом всього процесу.

Пізніше, цей оригінальний процес ПРЛ був значно вдосконалений використанням ДНК-полімерази, взятої з термофільних (теплолюбивих) бактерій, що зазвичай ростуть в гейзерах в температурі понад 110 °C. ДНК-полімераза, взята з цих організмів, стійка при високих температурах, і при використанні у ПЛР не пошкоджується при нагріванні до необхідної температури. З тих пір, як необхідніть додавати нову ДНК-полімеразу на кожному циклі зникла, процес копіювання ДНК був спрощений і автоматизований.

Одна з перших теплостійких ДНК-полімераз була отримана від бактерії Thermus aquaticus і стала відома під назвою «Taq». Taq-полімераза широко використовується для ПЛР і зараз. Проте, її недоліком є те, що через відсутність механізму корекції помилок у 3'→5' напрямку, вона робить відносно велику кількість помилок при копіюванні ДНК, що приводить до мутацій. Нові полімерази, такі як Pwo або Pfu, отримані від архей, мають такий механіхм корекції і можуть значно скоротити число мутацій, які зустрічаються в копійованій послідовності ДНК. Проте ці ферменти полімеризують ДНК набагато повільніше, ніж Taq. Зараз доступні комбінації Taq і Pfu, що забезпечують як високу процесивність (протяжность ділянки, що синтезується за одне зв'язування ферменту, і в результаті швидкість синтезу), так і високу точність копіювання ДНК.

ПЛР зараз може виконуватися на фрагментах ДНК розміром більше 10 kbp (тисяч пар основ), але середній розмір ділянки ДНК, що ампліфікується, від кількох сотень до кількох тисяч пар основ ДНК. Проблема з довгими фрагментами в великій кількості помилок та довгому часі реакції, тому необхідно підтримувати в баланс між точністю і просесивністю фермента. Зазвичай, чим довше ділянка, тим більше ймовірність помилок.

Метод ПЛР був запатентований корпорацією Cetus, де працював Мулліс, скоро після її відкриття. Використання Taq-полімерази також було захищене патентами. Проте, відбулося кілька високопрофільних судових процесів щодо цього метода, зокрема невдалий судовий процес, ініційований компанією DuPont. Фармацевтична компанія Hoffmann-La Roche придбала права на патенти в 1992 році і зараз має всі права на ПЛР. Битва патентів на право використання фермента Taq-полімерази все ще продовжується в кількох юрисдикціях по всьому світу між компаніями La Roche і Promega. Цікаво, компаніям вдалося продовжити права на ПЛР і Taq на час після закінчення початкового патенту 28 березня 2005 року[4].

[ред.] Принцип дії

[ред.] Необхідні компоненти

Малюнок 1: Типовий ампліфікатор для ПЛР

Метод заснований на багатократному виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro (в штучних умовах). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку.

За допомогою ПЛР зазвичай можуть бути ампліфіковані відносно короткі (до 10 kbp) ділянки ДНК з відомими кінцями, у окремих випадках можуть використовуватися ділянки до 40kbp. Для проведення ПЛР в найпросішому випадку потрібні наступні компоненти:

ПЛР проводять в ампліфікаторі — приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання тестових трубочок з розчином, зазвичай з точністю не менше 0,1 °C.

[ред.] Праймери

Малюнок 2: Схематичне зображення процесу ПЛР. (1) Денатурація при 94-96°C. (2) Відпал при ~65°C (3) Елонгація при 72 °C. На малюнку зображені чотири цикли реакції.

Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею і праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18—30 основ. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів двланцюжкової матриці, обрамляючи початок і кінець ампліфікуємої ділянки.

Після гібридизації матриці з праймером (відпал [5]), останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюжка матриці (див. ниже).

Найважливіша характеристика праймерів — температура плавлення (Tm) комплексу праймер-матриця. Вона визначається, як температура, при якій половина ділянок скріплення праймера зайнята. Tm можна приблизно визначити по формулі T_m = 2\cdot(n_A+n_T)+4\cdot(n_G+n_C), де nX — кількість нуклеотідов Х в праймері. Якщо праймер короткий і Tm мала, то праймер може опинитися частково комплементарен іншим ділянкам матричної ДНК, що може привести до появи неспецифічних продуктів. Зверху температура плавлення обмежена оптимумом дії полімерази, активність якої зазвичай падає при температурі вище 80 °C. Тому розробка праймерів — необхідна задача, яку слід виконати перед початком ПЛР.

При виборі праймеров бажано дотримуватися наступних критеріїв:

  • вміст GC ~ 40—60 %;
  • близькі Tm праймерів (відмінності не більш, ніж на 5 °C);
  • відсутність неспецифічних вторинних структур — шпилек[6] і димерів[7];
  • бажано, щоб на 3’-кінці був гуанін або цитозин.

[ред.] Хід реакції

Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20—35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (див малюнок 2):

  1. Дволанцюжкову ДНК-матрицю нагрівають до 94—96°C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5—2 хв., щоб ланцюги ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією — руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюжками. Іноді перед першим циклом проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2—5 хв. для повної денатурації матриці і праймеров.
  2. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноланцюжковою матрицею. Ця стадія називається відпалом (англ. annealing). Температура відпалу залежить від праймерів і зазвичай вибирається на 4—5°С нижче за їх температуру плавлення. Час стадії — 0,5—2 хв.
  3. ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюжок, використовуючи праймер як затравку. Це так звана стадія елонгації. Температура елонгації залежить від полімерази. Полімерази Taq і Pfu, що найчастыше використовуються, найбільш активні при 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини ампліфікуємого фрагмента. Звичайний час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 10—15 хв.

[ред.] Різновіди ПЛР

  • Вкладена ПЛР (англ. Nested PCR) — застосовується для зменшення частки побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів і проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймеров ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.
  • Інвертована ПЛР (англ. Inverse PCR) — використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка усередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити фланкуючі послідовності після вставки ДНК в геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізів ДНК рестріктазами з подальшим ліґуванням. В результаті відомі фрагменти утворюються на обох кінцях невідомої ділянки, після чого можна проводити ПЛР як завжди.
  • Асиметрична ПЛР (англ. Assymetric PCR) — проводиться тоді, коли потрібне ампліфікувати переважно один з ланцюжків початкової ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування і гібридізаційного аналізу. ПЛР проводиться як завжди, за винятком того, що один з праймеров береться у великому надлишку.
  • Кількісна ПЛР (англ. Quantitative PCR, Q-PCR) — використовується для швидкого вимірювання кількості певної ДНК, кДНК або РНК в пробі.
  • Кількісна ПЛР в реальному часі — в цьому методі використовують флуоресцентні мічені реагенти для точного вимірювання кількості продукту реакції у міру його накопичення.
  • Touchdown ПЛР (англ. Touchdown PCR) — за допомогою цього методу зменшують вплив неспецифічного скріплення праймерів на утворення продукту. Перші цикли проводять при температурі вище за температуру відпалу, потім кожні декілька циклів температуру знижують. При певній температурі система пройде через смугу оптимальної специфічності праймерів до ДНК.
  • Метод молекулярних колоній (або «ПЛР в гелі», англ. Polony - PCR Colony) — поліакріламідний гель полімеризують зі всіма компонентами ПЛР на поверхні і проводять термоциклування. У точках, що містять аналізуєму ДНК, відбувається ампліфікація з утворенням молекулярних колоній.
  • Геліказно-залежна ампліфікація (англ. Helicase-dependent amplification) — подібна до звичайной ПЛР, але реакція проходить при постійній температурі. Для роз'єднання ланцюжків ДНК використовується геліказа замість теплової денатурації.
  • ПЛР із швидкою ампліфікацією кінців кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE) — ампліфікація матричної РНК (мРНК) за допомогою відомого фрагмента усередині цієї молекули.
  • ПЛР довгих фрагментів (англ. Long-range PCR) — модифікація ПЛР для ампліфікації протяжних ділянок ДНК (10 kbp і більше). Використовують дві полімерази, одна з яких — Taq-полимераза з високою процесивністю (тобто полімераза здатна за один прохід синтезувати довгий ланцюг ДНК), а друга — ДНК полімераза з 3'-5' ендонуклеазною активністю. Друга полімераза необхідна для того, щоб коректувати помилки, внесені першою.
  • Випадкова ампліфікація поліморфної ДНК (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) — використовується тоді, коли потрібно розрізнити близькі по генетичній послідовності організми, наприклад, різні сорти культурних рослин, породи собак або близькоспоріднені мікроорганізми. У цьому методі зазвичай використовують один праймер невеликого розміру (20 — 25 bp). Цей праймер буде часткове комплементарний випадковим ділянкам ДНК досліджуваних організмів. Підбираючи умови (довжину праймера, його склад, температуру та ін.), вдається добитися задовільної відмінності картини ПЛР для двох організмів.
  • Мультиплексна ПЛР (англ. Multiplex PCR) — використання великого числа унікальних праймерів в одній реакції ПЛР для отримання кілька продуктів ПЛР різної довжини. Така реакція заміняє кілька окремих реакції ПЛР, які би вимагали більшу кількість реагентів та часу. Тепмератури відпалу кожного з наборів праймерів повинні бути оптимізовані, щоб вони могли правильно працювати в межах однієї реакції. Так саме як і розміри ампліфікуємих ділянок ДНК повинні достатньо відрізнятися, щоб їх було розрізніти за допомогою гелевого електрофорезу.
  • Мультиплексна ампліфікація проб за допомогою ліґування (англ. en:Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) дозволяє ампліфікувати кілька ділянок ДНК за допомогою однієї пари праймерів.

Якщо нуклеотидна послідовність матриці відома лише частково або невідома зовсім, можна використовувати вироджені праймери, послідовність яких містить вироджені позиції, в яких можуть розташовуватися будь-які букви. Наприклад, послідовність праймера може бути такій: .ATH., де Н заміняє собою A, T або C.

[ред.] Використання

Малюнок 3: Результати гелевого електрофорезу продіктів ПЛР, візуалізовані за допомогою етідіум броміда. Два набіра праймерів використовавалися для ампліфікації гена IGF з трьох різних зразків тканин. У зразку 1 (Tissue 1) ген відсутній, і не був ампліфікований, тоді як смуги у зразках 2 і 3 вказують на успішну ампліфікацію цього гену. У якості позитивного контролю використовується шкала ДНК, яка містить фрагменти ДНК різної довєини (стовпчик праворуч) для оцінки розміоу продуктів реакції ПЛР.
Малюнок 4: Клонування гена за допомогою плазміди.
(1) Хромосомна ДНК організму A. (2) ПЛР. (3) Багато копій одного гену з організму A. (4) Вставлення гену в плазміду. (5) Плазміда з геном з організму A. (6) Вставлення плазміли в організм B. (7) Експресія гену з організму A в організмі B.
Малюнок 5: Елескрофорез фрагментів, ампліфікованих за допомогою ПЛР.
(1) Батько.
(2) Дитина.
(3) Мати.
Дитина придбала деякі, але не всі, лінії своїх генетичних відбитків пальців від кожного із своїх батьків, створюючі новий унікальний набір.

[ред.] Ізоляція генетичного матеріалу

Велика частина ефективності ПЛР знаходиться в його здатності легко ізолювати специфічні регіони послідовності ДНК з маретіалу цілого генома. Для багатьох методів потрібний резервуар молекул ДНК, ізольованих із специфічного фрагмента ДНК, і використання ПЛР зробило всі ці методи більш ефективними. Оскільки ПЛР також ампліфікує ізольований регіон, методи потребує дуже маленьких кількостей матеріалу для аналізу.

[ред.] Секвенування ДНК і виявлення генетичних хвороб

Як тільки створений зразок, в якому всі молекули походять від єдиного регіону ДНК, можливо здійснити секвенування (встановлення послідовності) ДНК для визначення невідомої послідовності нуклеотидів фрагменту між двома праймерами. Один з праймерів ПЛР зазвичай використовується як якір для метода Зангера, найзагальнішого зараз метода секвенування. Цей метод зазвичай використовується для діагностики генетичних захворювань; доктор може підтвердити діагноз, спостерігаючи відмінності послідовності ДНК, які, як відомо, пов'язані з захворюванням.

[ред.] Методи рекомбінації ДНК

ІзолЯція фрагмента ДНК дозволяє проведення методів рекомбінантної маніпуляції ДНК, які залучають вставку наданої послідовності ДНК до генетичного матеріалу іншого організму (зараз такі організми відомі як генетично змінені організми, ГЗО або GMO). ПЛР часто використовується для ампліфікації гена, який потім може бути вставлений в інший геном через відповідний процес рекомбінації або, звичайніше, вставлений у вектор (наприклад, плазміду), який несе ДНК в цільовому організмі.

[ред.] Використання в криміналістиці та встановлення батьківства

Метод генетичних відбитків пальців (англ. genetic fingerprinting) — метод, що використовується в криміналістиці для ідентифікації людини, порівнюючи її ДНК з ДНК в наданому зразку. ПЛР звичайно використовувається для ампліфікації набору певних регіонів ДНК, про які відомо, що воні змінюються в довжині від людини до людини. Комбінація довжин всіх цих регіонів, які потім розділяються за допомогою гелевого електрофорезу, створює «генетичний відбиток пальців». Із застосуванням ПЛР теоретично потрібна лише одна молекула ДНК для певної ідентифікації, хоча у окремих випадках саме ця чутливіть збільшує ризик помилок через можливе забруднення, і ампліфікацію в результаті ДНК з зовнішніх джерел. Існує кілька методів генетичних відбитків пільців, але всі воні звичайно використовують гелевий електрофорез, після чого зразок фарбуеться за допомогою етідіум броміда або інших фарбників, або спостерігається за допомогою гібридизації з пробами ДНК за допомогою саузерн-блоттінга.

На практиці необхідний зразок генетичного матеріалу збирається з місця злочину — кров, слина, сперма, волосся тощо Цей зразок порівнюють з генетичним матеріалом підозрюваного. Оскільки є невелика вірогідність, що у двох чоловік відбитки виявляться схожими, цей метод частіше використовується для доказу невинності підозрюваного.

Хоча «генетичні відбитки пальців» унікальні (за виключенням випадку однояйцевих близнят), споріднені зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши декілька таких відбитків (див. малюнок). Той же метод можна застосовувати, злегка модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

[ред.] Ампліфікація та вимірювання кількості ДНК

Оскільки ПЛР ампліфікує регіони ДНК, він може використовуватися для аналізу надзвичайно невеликих кількостей зразку. Крім того, кількість часу, потрібна для ампліфікації ДНК до наданого рівня, залежить від її кількості в початковому зразку, завдяки чому ПЛР може також використовуватися для визначення кількості ДНК.

[ред.] Аналіз стародавньої ДНК

Використовуючи ПЛР, стає можливим проаналізувати ДНК, якій кілька тисяч років. Методи ПЛР були успішно використані на деяких стародавніх тваринах, наприклад мамонті віком у 40 тис. років та на людській ДНК з стародавніх гробниць, наприклад, єгипетських мумій.

[ред.] Ідентифікація вірусної ДНК

Вірусні захворювання також можуть бути ідентифіковані за допомогою ПЛР. Використовуючи праймери, специфічні для даного віруса, ПЛР може успішно ампліфікувати ДНК та виявити, чи присутній в ньому вірус. Оскільки ПЛР дуже чутливий, такий аналіз часто можливий скоро після інфекції, яка може відбутися від кількох днів до кількох місяців або навіть років до появи фактичних симптомів. Таке раннє виявлення надають лікарям істотну допомогу в лікуванні. Лікарі можуть також використовувати методи кількісної оцінки ДНК для визначення кількісті вірусу («вірусний вантаж») в пацієнті.

[ред.] Оцінка кількості ДНК і визначення експресії генів

Тому що кількість продукту, отриманого за допомогою ПЛР, залежить від кількості початкового матеріалу, ПЛР може використовуватися для оцінки кількості копій наданої послідовності, які присутні в зразку — техніка, особливо корисна для визначення рівнів експресії генів. У клітинах кожен ген експресується через виробництво матричної або транспортної РНК (тРНК), яка потім використовується для трансляції у білки, відповідні гену. Кількість РНК в клітині для даного гена показує, наскільки ген зараз активний. Використовуючи зворотну транскрипцію для отримання ДНК, комплементарного мРНК (кДНК) і згодом використовуючи РЛР для ампліфікаці цих молекул, можливо визначити рівень експресії гену.

Точніші вимірювання можливі, якщо кількість дволанцюжкової ДНК вимірювається після кожного циклу ПЛР, метод відомий як «кількісний ПЛР в реальному часі». До суміші додається фарбник, який становиться флуоресцентним при контакті з ДНК, і кількість ДНК може бути визначена по інтенсівності флуоресценції.

[ред.] Коментарі та посилання

  1. ↑ а б Mullis, Kary. Dancing Naked in the Mind Field (1998), Pantheon Books. ISBN 0-679-44255-3.
  2. ↑ Rabinow, Paul. Making PCR: A Story of Biotechnology (1996), University of Chicago Press. ISBN 0-226-70146-8.
  3. ↑ Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 1990;262(4):56-61, 64-5.
  4. ↑ Advice on How to Survive the Taq Wars ¶2: GEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Article. May 1 2006 (Vol. 26, No. 9).
  5. ↑ Відпал (англ. annealing) — гібридизація фрагментів ДНК
  6. ↑ Шпилька — внутрішньомолекулярна самокомплементарна структура
  7. ↑ Димери праймерів — міжмолекулярні структури, що утворюються праймерами один з одним або з самим собою

[ред.] Ресурси Інтернет

Commons
ВікіСховище має мультимедійні дані за темою:

Отримано з http://uk.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%BE%D0%BB%D1%96%D0%BC%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%BD%D0%B0_%D0%BB%D0%B0%D0%BD%D1%86%D1%8E%D0%B3%D0%BE%D0%B2%D0%B0_%D1%80%D0%B5%D0%B0%D0%BA%D1%86%D1%96%D1%8F
Особисті інструменти