Піросеквенування

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до: навігація, пошук
Піросеквенсер Pyromark Q24 з робочою станцією

Піросеквенсування (англ. Pyrosequencing, швед. Pyrosekvensering) — метод визначення послідовності нуклеотидів ДНК, що ґрунтується на принципі «синтез через інкорпорацію», на відміну від секвенування Сенгера (англ. Sanger sequencing), де використовуєтсья капілярний електрофорез. Цю технологію створили дослідники Пол Нюрен (швед. Pål Nyrén) та його PhD-студент Мостафа Ронаджі (англ. Mostafa Ronaghi) у Королівському Технічному Інституті (швед. Kungliga Tekniska Högskolan, KTH) у Стокгольмі, у 1996 р.[1]

Галузі застосування[ред.ред. код]

Технологія[ред.ред. код]

Крок 1[ред.ред. код]

Ампліфікація сегменту ДНК за допомогою ПЛР, при цьому один з праймерів — біотинильований. Після денатурації, біотинильований одноланцюговий ПЛР-амплікон ізолюється та гібридизується з sequencing-праймером.

Крок 2[ред.ред. код]

Гібридизований праймер та одноланцюговий ПЛР-амплікон інкубуються з наступними ензимами: ДНК-полімераза, АТФ-сульфураза, люцифераза, апіраза, а також з субстратами аденозин-5'-фосфосульфатом (АФС) та люциферином.

Крок 3[ред.ред. код]

До реакції додається один з деоксирибонуклеотид-три-фосфат (дНТФ) — дАТФ, дТТФ, дГТФ чи дЦТФ. ДНК-полімераза каталізує додавання певного дНТФ до sequencing-праймера. Коли є комплементарність до нуклеотида в ланцюгу ПЛР-амплікона, відбуваєтсья інкорпорація. Кожна вдала інкорпорація супроводжується вивільненням пірофосфату (ПФі), в кількості, що еквімолярна кількості інкорпорованих нуклеотидів.

Крок 4[ред.ред. код]

Типовий приклад Пірограми, в якій демонструється послідовність нуклеотидів певного фрагменту ДНК

.

АТФ-сульфураза конвертує ПФі в АТФ в присутності АФС. Цей АТФ реагує з люциферином, внаслідок чого люциферин конвертуєтсья в оксилюциферин, що супроводжуєтсья генерацією видимого світла, кількість якого пропрорційна кількості АТФ. Це світло, що продукуєтсья внаслідок люциферин-каталізуючої реакції фіксується спеціальними CCD-сенсорами, які передають сигнал до комп'ютера, програмне забезпечення якого конвертує сигнали та виводить дані у вигляді піків, з яких формується пірограма (англ. Pyrogram). Висота кожного піка пропорційна кількості інкорпорованих нуклеотидів.

Крок 5[ред.ред. код]

Завдяки апіразі відбувається деградація неінкорпорованих нуклеотидів та АТФ. Коли деградація завершуєтсья, додаєтсья інший нуклеотид.

Крок 6[ред.ред. код]

Додавання дНТП відбуваєтсья послідовно. Слід зазначити, що деоксиаденозин алфа-тіо трифосфат використовується для заміни природнього деоксиаденозин-трифосфату дАТФ, який використовується ДНК-полімеразою, але не взаємодіє з люциферазою. Коли процес продовжується, комплеметарний ланцюг ДНК елонгується та формує послідовність нуклеотидів та у вигляді сигналів (піків) відображається як пірограма.

Посилання[ред.ред. код]

Посилання[ред.ред. код]

  1. Ronaghi et al. (2000). «Improved performance of Pyrosequencing using single-stranded DNA-binding protein». Analytical Biochemistry 286. с. 282-288 Зайве |pages= або |at= (довідка). doi:10.1006/abio.2000.4808". PMID 11067751. 

Див. також[ред.ред. код]