Фарбування за Грамом

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до: навігація, пошук
Грам-позитивні бактерії сибірської виразки (фіолетові палички) в зразку спинномозкової рідини. Грам-негативні бактерії були б рожевого кольору. Інші клітини — білі кров'яні тільця)

Фарбування за Грамом (або метод Грама) — емпірично виведений метод розрізнення бактерій за допомогою фарбування їх певним методом на дві великі групи: Грам-позитивні і Грам-негативні), що розрізняються хімічними та фізичними властивостями їх клітинної стінки.

Етимологія[ред.ред. код]

Метод називається на честь його винахідника, данського вченого Ганса Хрістіана Грама (1853–1938), який розробив цей метод у 1884 році щоб розрізнити бактерії Pneumococcus і Klebsiella pneumoniae.

Використання[ред.ред. код]

Фарбування за Грамом — одна з найкорисніших фарбувальних процедур у лабораторних дослідженнях в мікробіології. Процедура широко використовується як інструмент для розрізнення Грам-негативних і Грам-позитивних бактерій, що звичайно є першим кроком у визначенні ідентичності специфічного бактерійного зразка.

У медицині фарбування за Грамом виконується при аналізі крові або біопсії, коли підозрюється інфекція. Цей метод набагато швидший, ніж культура, і особливо важливий, коли визначення типу інфекції необхідно для прогнозу та вибору методу лікування. Наприклад, при діагностиці цереброспінальної рідини на менінгіт і рідини суглобів на септичний артрит.

При аналізі, наприклад, Коки і спороносні форми бактерій, а також дріжджі — грам-позитивні і забарвлюються в синяво-чорний (темно-синій) колір, більшість інших бактерій — грам-негативні і забарвлюються в червоний колір, ядра клітин еукаріот набувають яскраво-червоного кольору, а цитоплазма — рожевого.

Техніка проведення фарбування[ред.ред. код]

Фарбування за Грамом відноситься до складного способу фарбування, коли на мазок впливають двома фарбниками, з яких один є основним, а інший — додатковим. Окрім фарбувальних речовин при складних способах забарвлення застосовують обезбарвлюючі речовини: спирт, кислоти та ін. Для фарбування за Грамом частіше використовують барвники трифенілметанової групи: генціановий, метиловий фіолетовий або кристал віолет. Грам-позитивні (Грам (+)) мікроорганізми дають міцне з'єднання з вказаними барвниками і йодом. При цьому вони не обезбарвлюються при дії на них спиртом, унаслідок чого при додатковому забарвленні фуксином Грам (+) мікроорганізми не змінюють спочатку приєднаний фіолетовий колір.

Грам-негативні (Грам (-)) мікроорганізми утворюють з основними барвниками і йодом з'єднання, що легко руйнується під дією спирту. В результаті мікроби обезбарвлюються і потім забарвлюються фуксином, набуваючи червоного кольору.

Підготовка матеріалу для фарбування[ред.ред. код]

Матеріал, що досліджується, розподіляють тонким шаром по поверхні добре знежиреного скла. Приготований мазок висушують на повітрі і після повного висихання фіксують.

Фіксація[ред.ред. код]

При фіксації мазок закріплюється на поверхні скла, і тому при подальшому фарбуванні препарату клітини не змиваються. Крім того, убиті мікробні клітини забарвлюються краще, ніж живі. Розрізняють фізичний спосіб фіксації, в основу якого покладена дія високої температури на клітину, і хімічні способи, що передбачають застосування хімічних засобів, що викликають коагуляцію білків цитоплазми.

Фізичний спосіб фіксації: Скло з препаратом беруть пінцетом і плавним рухом проводять 2-3 рази над верхньою частиною полум'я пальника. Весь процес фіксації повинен займати не більше, ніж 2 с. Надійність фіксації перевіряють наступним прийомом: вільну від мазка поверхню скла прикладають до тильної поверхні лівої кисті. При правильній фіксації скло повинне бути гарячим, але не викликати відчуття опіку (70—80 °С).

Хімічний спосіб фіксації: Для фіксації мазків застосовують метиловий спирт, ацетон, суміш Никіфорова (суміш етилового спирту 96% і наркозного ефіру в співвідношенні 1:1), рідина Карнуа (етилового спирту 96% — 60%, хлороформу 30%, крижаної оцетової кислоти 10%). Скло з висушеним мазком занурюють в склянку з фіксуючою речовиною на 10-15 хвилин і потім висушують на повітрі.

Процес фарбування[ред.ред. код]

  1. На фіксований мазок наливають один з основних барвників на 2—3 хвилини. Щоб уникнути осаду фарбують через фільтрувальний папір.
  2. Зливають фарбу, акуратно видаляють фільтрувальний папір. Мазок заливають на 1—2 хв розчином Люголя або йодистим розчином, за Грамом (водний розчин йодиду калію і кристалічного йоду в співвідношенні 2:1) до почорніння препарату.
  3. Розчин зливають, мазок прополіскують 96° етиловим спиртом або ацетоном, наливаючи і зливаючи його, поки мазок не знебарвиться і рідина, що стікає, не стане чистою (приблизно 20-40-60 секунд).
  4. Ретельно промивають скельця в проточній або дистильованій воді 1—2 хв.
  5. Для виявлення грам-негативних бактерій препарати додатково фарбують фуксином або сафраніном (2—5 хв).
  6. Промивають в проточній воді і висушують фільтрувальним папером.

Посилання[ред.ред. код]