Глікогенфосфорилаза

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до: навігація, пошук
Глікоген фосфорилаза
PDB 1ygp EBI.jpg
Фосфорильована форма глікогенфосфорилази дріжджів із молекулою фосфату в активному центрі
Ідентифікатори
Символ людські ізоферменти PYGM, PYGL, PYGB
Номер CAS 9035-74-9
Інша інформація
Шифр КФ 2.4.1.1

Глікоге́нфосфорила́за (1,4-α-D-глюкан:ортофосфат α-глікозилтрансфераза) — фермент, що каталізує лімітуючу стадію процесу глікогенолізу: розщеплення глікогену до глюкозо-1-фосфату шляхом фосфоролізу.

Глікогенфосфорилазу інколи називають просто фосфорилазою, через те що це перший відкритий фермент із фосфорилазною активністю.

Історія дослідження[ред.ред. код]

Глікогенфосфорилаза була першим відкритим ферментом класу фосфорилаз. Під час її дослідження вперше встановлено можливість регуляції ферменту шляхом фосфорилювання/дефосфорилювання. Глікогенфосфорилаза також була одним із перших відомих алостеричних ферментів, і першим, для якого були встановлені точні тримірні структури активної та інактивованої форми за допомогою рентгеноструктурного аналізу[1].

У 1930-их роках Карл та Герті Корі встановили, що гілкогенфосфорилаза скелетних м'язів може перебувати у двох формах, що перетворюються одна в одну: каталітично активна фосфорилаза a та неактивна фосфорилаза b. Подальші дослідження цього ферменту проводив Ерл Сазерленд, який з'ясував, що фосфорилаза b переважає у м'язах в стані спокою, в той час як фосфорилаза a — під час активних скорочень. Перетворення неактивної форми в активну відбувається під впливом адреналіну[1]. 1959 року Едвін Кребс та Едмонд Фішер встановили, що a та b форми фосфорилази відрізняються наявністю фосфатної групи, приєднаної до залишку серину 14[2]. Високороздільний рентгеноструктурний аналіз обидвох форм провели Роберт Флеттерік та Луї Джонсон[3].

Структура глікогенфосфорилази[ред.ред. код]

Глікогенфосфорилаза — це димер двох ідентичних субодиниць довжиною по 842 амінокислотні залишки (97 кДа)[4]. До складу кожної субодиниці входить амінокінцевий (залишки 1—484) та карбоксикінцевий домени (залишки 485–842). Амінокінцевий домен у свою чергу поділяється на два субдомени, один із яких містить місце ковалентоної модифікації (Сер14), алостеричні сайти, та поверхню взаємодії із іншим мономером в димері. Другий субдомен містить сайт зв'язування глікогену (залишки 316–484)[3].

Активний центр розташований у центрі субодиниці між N- і C-кінцевим доменами. Він віддалений від сайту зв'язування глікогену приблизно на 30 Å і сполучений із ним вузькою щілиною, в яку поміщається 4—5 залишків глюкози. Ця щілина має радіус кривини відповідний до радіуса спіральної гілки глікогену і є надто вузькою, щоб захопити місце галуження ((α1→6)-зв'язок)[3][5].

Розділення активного сайту та сайту зв'язування глікогену дозволяє ферменту каталізувати розщеплення багатьох глікозидних зв'язків в одній молекулі глікогену без потреби від'єднуватись і знову приєднуватись до неї. Таким чином збільшується процесивність ферменту[5].

Механізм реакції[ред.ред. код]

Глікогенфосфорилаза каталізує реакцію, в якій ортофосфатна кислота атакує (α1→4)-глікозидний зв'язок між останнім та передостаннім залишками глюкози із нередукуючого кінця гілки глікогену, внаслідок чого виділяється глюкозо-1-фосфат. Ця реакція дозволяє зберегти більшу частину енергії глікозидного зв'язку завдяки формуванню естеру[6].

Glycogen phosphorylase reaction.svg

Реакція повинна відбуватись таким чином, щоб виключити наявність води в активному центрі, оскільки в протилежному випадку замість фосфоролізу відбудеться гідроліз, і на фосфорлиювання утвореної глюкози потрібно буде затратити АТФ[7].

Піридоксаль-5'-фосфат формує основу Шиффа із лізином в активному центрі глікогенфосфорилази

Кілька експериментальних спостережень дозволяють робити припущення про механізм реакції. По-перше як субстрат (гілкоген) так і продукт (глюкозо-1-фосфат) реакції перебувають у α-конфігурації. Якщо б відбувалась пряма атака ортофосфату на глікозидний зв'язок, це супроводжувалось би інвертуванням конфігурації C-1 (утворювався би β-глюкозо-1-фосфат), через те що реакція проходила б через пентаковалентинй проміжний стан. Оскільки α-кофігурація зберігається, реакція повинна відбуватись у парну кількість етапів (у напростішому випадку — два), найбільш імовірно, через формування проміжної сполуки карбкатіону[5] (резонує із іоном Оксонію[8]).

По-друге для протікання реакції фосфоролізу необхідна присутність кофактора піридоксаль-5'-фосфату (ПЛФ) (похідного вітаміну B6), приєднаного до Ліз679 через формування основи Шиффа. Структурний аналіз показав, що ортофосфат займає положення між 5'-фосфатною групою ПЛФ та глікогеном. 5'-фосфатна група ПЛФ може відігравати роль загального кислотно-основного каталізатора, спочатку донуючи протон, а потім перетворюючись у його акцептор[5].

Можливий такий механізм реакції: ортофосфат (у формі HPO2-4) донує протон атому Оксигену, що утворює (α1→4)-зв'язок, і одночасно набуває протона від фосфатної групи ПЛФ. Таким чином формується перехідна сполука карбоній-оксоній катіон у конформації півкірсла. Він атакується ортофосфатом, внаслідок чого відбувається утворення глюкозо-1-фосфату та повернення протона до ПЛФ[8][5][9].

Glycogen phophorylase mechanism.svg

Глікогенфосфорилаза відщеплює по одному залишку глюкози від нередукуючого кінця, поки не наближається до точки галуження ((α1→6)-зв'язку) на відстань чотирьох залишків, де її активність припиняється і може бути відновлена тільки після дії дерозгалужуючого ферменту[10].

Термодинаміка фосфорилазної реакції[ред.ред. код]

У реакції, каталізованій глікогенфосфорилазою, велика частина енергії глікозидного зв'язку зберігається завдяки формуванню естеру із фосфатною кислотою. Через це стандартна зміна вільної енергії (ΔG0') є невеликою і реакція може протікати (+3,1 кДж/моль[11]) in vitro як у прямому так і зворотному напрямку. За pH 6,8 рівновага встановлюється при співвідношенні [ортофосфат]/[глюкозо-1-фосфат] близько 3,6. Проте за реальних умов in vivo це співвідношення переважно перевищує 100, через що рівновага сильно зміщується в сторону розщеплення глікогену[12], а реальна зміна вільної енергії ΔG = −8 кДж/моль. Тобто фосфороліз глікогену є екзергонічним процесом[11].

Регулювання активності фермену[ред.ред. код]

Активність глікогенфосфорилази є об'єктом багаторівневих механізмів регулювання. По-перше, вона приводиться у відповідність потребам клітини завдяки дії алостеричних модудяторів. По-друге, фермент може активуватись/інактивуватись шляхом ковалентної модифікації (фосфорилювання), що здійснюється під впливом гормонів (глюкагону, адреналіну та інсуліну), таким чином активність глікогенфосфорилази змінюється в залежності від потреб цілого організму. По-третє, ізоферментний склад глікогенфосфорилази відрізняється у різних органах, зокрема в людини є печінкова, м'язова та мозкова форми, кожна із яких має свої особливості регулювання. Це пов'язане із тим, що функції глікогенолізу не однакові у різних тканинах: наприклад, у м'язах він потрібний для забезпечення їх енергією під час скорочень, а у печінці — для підтримання стабільного рівня глюкози в крові.

Форми глікогенфосфорилази[ред.ред. код]

Перехід a та b форм глікогенфосфорилази між напруженою та розслабленою конформаціями

Існує дві форми глікогенфосфорилази, що перетворюються одна в одну: переважно активна (фосфорильована) фосфорилаза a та переважно неактивна (нефосфорильована) фосфорилаза b. Кожна із цих форм у свою чергу може перебувати в одній із двох конформацій: каталітично активній розслабленій R (від англ. relaxed) та каталітично неактивній напруженій T (від англ. tense). Для фосфорилази a рівновага зміщена в сторону переходу в R стан, тоді як більшість фосфорилази b перебуває у T стані[13].

Конформаційний перехід від T до R стану передбачає поворот мономерів на 10° навколо осі симетрії другого порядку димеру. Внаслідок чого відбувається зміна розташування α-спіралей і вихід із активного центру петлі, що закривала його у T-стані і перешкоджала зв'язуванню субстрату[14][15]. Окрім того відбувається поворот бічного ланцюга залишку аргініну 569 поблизу піридоксль-5'-фосфату, через що збільшується спорідненість ферменту до ортофосфату[15]. Перехід між напруженою та розслабленою формами ферменту регулюється зв'язуванням алостеричних модуляторів, які відрізняються у різних тканинах.

Алосетрична регуляція глікогенфосфорилази[ред.ред. код]

Алостерична регуляція м'язової та печнкової ізоформ глікогенфосфорилази

У розслаблених м'язах фосфорилаза b переважає над a формою. Більшість молекул фосфорилази b перебувають у неактивному T стані, проте вони можуть переходити у R конформацію під впливом позитивного алостеричного модулятора: АМФ, високий рівень якого свідчить про низький енеретичний статус клітини. Алостеричним інгібіторами глікогенфосфорилази b є АТФ, що конкурує із АМФ за зв'язування з ферментом, та глюкозо-6-фосфат, який забезпечує негативний зворотний зв'язок у цьому метаболічному шляху (кінцевий продукт пригнічує активність першого ферменту). Під впливом гормональних сигналів може відбуватись фосфорилювання глікогенфосфорилази, внаслідок чого вона переходить в a форму, активність якої не залежить від алостеричних модуляторів[16][15].

Іншим шляхом відбувається регуляція активності глікогенфосфорилази у печінці. Оскільки завданням цього органу є підтримання сталого рівня глюкози в крові, то печінковий ізофермент інгібується високими концентраціями глюкози. При чому алостеричний модулятор діє на a, а не на b форму. Глікогенфосфорилаза печінки не чутлива до концентрації АТФ та АМФ, оскільки у гепатоцитах не відбувається такої різкої зміни запасів енергії як у м'язових волокнах[14].

Регуляція шляхом ковалентної модифікації[ред.ред. код]

Окрім алостеричних модуляторів на каталітичну активність глікогенфосфорилази впливає ковалентна модифікація, що відбувається у відповідь на дію гормонів. Перетворення переважно неактивної фосфорилази b у переважно активну фосфорилазу a здійснюється завдяки фосфорилюванню по залишку серину 14 кіназою фосфорилази. Для зворотного переходу необхідна активність фосфопротеїнфосфатази 1 (фосфатази фосфорилази a). Ці ферменти у свою чергу також підлягають складним механізмам реглуювання.

Активація фосфорилази під впливом глюкагону та адреналіну[ред.ред. код]

Активація глікогенфосфорилази у м'язах під впливом адреналіну

Гормони глюкагон та адреналін активують глікогенфосфорилазу через каскад сигнальних реакцій. Перший із них виділяється під час голодування, другий — під час фізичної активності або її очікування. Глікогеноліз у печінці чутливіший до дії глюкагону, а у м'язах — до адреналіну[17].

Обидва гормони діють через рецептори спряжені з G-білками: β-адренергічний рецептор у м'язах та печінці та глюкагоновий рецептор у печінці. Після зв'язування із лігандом рецептори передають сигнал тримерному Gs-білку. Останній активує мембранний фермент аденілатциклазу, що каталізує утворення циклічного АМФ із АТФ. Підвищена концентрація цАМФ викликає суттєве збільшення каталітичної активності протеїнкіанзи А (цАМФ-залежної протеїнкінази), а та у свою чергу фосфорилює кіназу фосфорилази. Після цього кіназа фосфорилази модифікує глікогенфосфорилазу b і перетворює її в a форму[18].

Окрім фосфорилювання кіназа фосфорилази може активуватись також і підвищеними концентраціями кальцію у цитоплазмі, оскільки містить у своєму складі кальмодулін в якості регуляторної субодиниці. У м'язах рівень кальцію зростає під час скорочень, тоді як у печінці це може відбуватись під впливом адреналіну, що діє через α-адренергічний рецептор[18].

Одночасно із активацією кінази фосфорилази відбувається інкативація фосфопротеїнфосфатази 1. Цей білок має у своєму складі регуляторну субодиницю, у м'язах — GM, а в печінці GL. Ці поліпептиди кріплять каталітичну субодиницю ФФ1 до її субстратів та глікогену. У м'язових волокнах GM регулюється шляхом фосфорилювання: протеїнкіаназа А приєднує залишок фосфатної кислоти у специфічному сайті 2 (можливе також фосфорилювання іншими кіназами по сайту 1, що має протилежний ефект), що призводить до дисоціації ФФ1 у цитоплазму, де вона не має доступу до фосфорилази a та кінази фосфорилази. Крім того у цитоплазмі ФФ1 зв'язується із інгібіторними бліками, також модифікованими протеїнкіназою А, внаслідок чого її каталітична активність додатково пригнічується[19][20].

У печінці регуляторна субодиниця GL ФФ1 не контролюється шляхом фосфорилювання. Проте ФФ1 міцно приєднується до фосфорилази a в R формі і в такому стані є неактивною, аж поки не відбудеться R → T перехід, зокрема під впливом високих концентрацій глюкози[21].

Каскад ферментативних реакцій, що виникає під впливом гормонів забезпечує значне підсилення сигналу: x молекул гормону викликають вивільнення в кров 10 000x молекул глюкози гепатоцитами[22]. Після завершення дії гормонів глікогеноліз повинен швидко зупинятись, це забезпечується фосфопротеїнфосфатазою 1, що дефосфорилює як глікогенфосфорилазу, так і кіназу фосфорилази[18].

Інактивація глікогенфософилази під впливом інсуліну та глюкози[ред.ред. код]

Гормон інсулін є антагоністом глюкагону, він виділяється у кров у відповідь на значне підвищення концентрації глюкози, і стимулює її захоплення і використання клітинами, в тому числі і для біосинтезу глікогену. Одночасно із активацією глікогенезу інсулін пригнічує глікогеноліз, а саме його ключовий фермент — глікогенфосфорилазу. У м'язах під впливом цього гормону активується інсулін-стимульована протеїнкіназа, що фосфорилює регуляторну GM субодиницю фосфопротеїнфосфатази 1 по сайту 1 (відмінний від сайту 2, який є субстратом для протеїнкінази А), що у свою чергу викликає її активацію. ФФ1 забезпечує перетворення активної фосфорилази a в неактивну b форму[20].

У печінці окрім інсуліну важливе значення для пригнічення глікогенолізу має власний «сенсор глюкози» — гілкогенфосфорилаза a. В активному R стані вона міцно зв'язує ФФ1 та пригнічує її каталітичну активність, під впливом підвищених концентрацій глюкози фосфорилаза a переходить у T конформацію, внаслідок чого фосфорильований Сер14 стає зручним субстратом для дефосфорилювання ФФ1. Одночасно знімається інгібування ФФ1, яка тепер може дефосфорилювати інші білки[23][21].

Еволюція глікогенфосфорилази[ред.ред. код]

Порівняння амінокислотної послідовності глікогенфосфорилази кишкової палички, дріжджів, слизовика Dictyostelium, картоплі, пацюків та людини показало наявність трьох консервативних послідовностей, що зазнали дуже мало змін впродовж еволюції: 15 амінокислотних залишків, що контактують із глюкозою в активному центрі, майже ідентичні у всіх досліджених організмів, дещо більш варіабельними є 15 амінокислот, що зв'язують пріридоксальфосфат та сайт зв'язування глікогену. Такі результати свідчать про те, що каталітичний механізм не змінився у процесі еволюції[24].

З іншого боку, суттєві відмінності спостерігаються у регуляторних сайтах. В той час як найпростіший тип регулювання — інгібування глюкозо-6-фосфатом, що забезпечує негативний зворотний зв'язок наявний у більшості досліджених організмів, амінокислоти необхідні для фосфорилювання ферменту і зв'язування нуклеотидів є тільки у глікогенфосфорилазі ссавців. Отже складніші механізми контролю ферментативної активності виникли пізніше у процесі еволюції[24].

Примітки[ред.ред. код]

  1. а б Nelson et al, 2008, p. 603
  2. Voet et al, 2011, p. 651
  3. а б в Voet et al, 2011, p. 640
  4. Voet et al, 2011, p. 639
  5. а б в г д Berg et al, 2007, p. 597
  6. Nelson et al, 2008, p. 595
  7. Berg et al, 2007, p. 596
  8. а б Watson KA, McCleverty C, Geremia S, Cottaz S, Driguez H, Johnson LN Phosphorylase recognition and phosphorolysis of its oligosaccharide substrate: answers to a long outstanding question // EMBO J. — 18 (1999) С. 4619-32. DOI:10.1093/emboj/18.17.4619. PMID 10469642.
  9. Voet et al, 2011, p. 642
  10. Nelson et al, 2008, p. 596
  11. а б Voet et al, 2011, p. 643
  12. Berg et al, 2007, p. 594
  13. Berg et al, 2007, p. 598
  14. а б Berg et al, 2007, p. 600
  15. а б в Voet et al, 2011, p. 648
  16. Berg et al, 2007, p. 599
  17. Berg et al, 2007, p. 601
  18. а б в Berg et al, 2007, p. 603
  19. Berg et al, 2007, p. 609
  20. а б Voet et al, 2011, p. 659
  21. а б Berg et al, 2007, p. 610
  22. Nelson et al, 2008, p. 604
  23. Voet et al, 2001, p. 662
  24. а б Berg et al, 2007, p. 604

Джерела[ред.ред. код]

  • Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2007). Biochemistry (вид. 6th). W.H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-8724-5. 
  • Nelson D.L., Cox M.M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry (вид. 5th). W. H. Freeman. ISBN 978-0-7167-7108-1. 
  • Voet D., Voet J.G. (2011). Biochemistry (вид. 4th). Wiley. с. 487—496. ISBN 978-0470-57095-1. 


Посилання[ред.ред. код]

  • David Goodsell Glycogen Phosphorylase — Molecule of the Month на сайті PDB, 2001. — Переглянуто 20 червня 2012 року.