Користувач:Dobropolka/Черновик
ChIP-on-chip (також відомий як ChIP-chip) метод аналізу ДНК-білкових взаємодій, що об'єднує імунопреципітацію хроматину ('ChIP') з гібридизацією на ДНК-мікрочіпах ("chip").
Для методу ChIP-on-chip імунопреципітований матеріал маркується флуоресцентними барвниками та гібридизується на ДНК-мікрочіпі, що містить від кількох тисяч до декількох мільйонів зондів [1].
Як і звичайний ChIP, ChIP-on-chip використовується для дослідження взаємодії білків і ДНК in vivo. Зокрема, це дозволяє визначити цистром (суму ділянок зв'язування) для ДНК-зв'язаних білків на основі генома. Повногеномний аналіз може бути проведений для визначення ділянок зв'язування майже для будь-якого білка, який представляє інтерес[2]. Як правило, це білки хроматину, що поділяються на гістонові та негістонові. Найбільш помітними представниками цього класу є фактори транскрипції, білки пов'язані з реплікацією(напр., складний білок розпізнавання походження (ORC)), гістони, їх варіанти та модифікації гістонів.
Метою методу ChIP-on-chip є знаходження сайтів зв'язування білка, які можуть допомогти визначити функціональні елементи в геномі. Наприклад, у випадку фактору транскрипції можна визначити його сайти зв'язування у всьому геномі. Інші білки дозволяють ідентифікувати промоторні області, енхансери, репресори та сайленсерні елементи, інсулятори, граничні елементи та послідовності, що контролюють реплікацію ДНК[3]. В дослідженні гістонів вважається, що розподіл модифікацій та їх локалізація можуть відкрити нові аспекти в розумінні механізму регуляції експресії генів.
Технологічна основа[ред. | ред. код]
Технічною платформою для проведення експериментів ChIP-on-chip є ДНК-мікрочіпи або "chips". Вони класифікуються та розрізняються за різними характеристиками:
Тип зонда: ДНК-мікрочіпи можуть містити або механічно помарковані кДНК, або ПЛР-продукт, або помарковані олігонуклеотиди, або олігонуклеотиди, які синтезуються in situ. Ранні версії мікрочіпів були розроблені для виявлення РНК з областей геному, що експресується (відкрита рамка зчитування, або ORF). Хоча такі тести цілком підходять для вивчення профілів експресії генів, вони мають обмежене значення в експериментах ChIP, оскільки більшість "цікавих" білків цієї методики зв'язуються в міжгенних регіонах. Сьогодні мікрочіпи можна виготовляти на замовлення і конструювати та налагоджувати відповідно до вимог експерименту. Також будь-яка послідовність нуклеотидів може бути синтезована для дослідження генних, а також міжгенних областей.
Розмір зонда: Рання версія кДНК-мікрочіпів мала довжину зонда приблизно 200н.п. В останніх версіях мікрочіпів використовуються зонді від 70н.п. (Microarrays, Inc.) до 25н.п. (Affymetrix).
Розмір матриці: Перші мікрочіпи, які використовували для ChIP-on-chip, мали близько 13,000 маркованих сегментів ДНК, що представляли усі ORF та міжгенні ділянки з геному дріжджів[3]. На сьогоднішні Affymetrix пропонує мікрочіпи повного геному дріжджів з роздільною здатністю 5 н.п. (загалом 3,2 мільйона зондів). Мікрочіпи для геному людини теж стають все більш потужними. Наприклад, Affymetrix пропонує набір із семи масивів з приблизно 90 мільйонами зондів, що охоплюють повну неповторювану частину геному людини з інтервалом у 35 к.п. (Лютий 2007).
Крім мікрочіпу, для проведення експериментів ChIP-on-chip необхідне обладнання для обробки та програмне забезпечення. Як правило, мікрочіпи однієї компанії не можуть бути проаналізовані обладнанням іншої компанії. Отже, придбання мікрочіпу вимагає також придбання відповідного обладнання для його аналізу. Найважливішими елементами є, серед іншого, гібридизаційні печі, сканери мікрочупів та програмне забезпечення для подальшого аналізу вихідних даних.
Методика експерименту ChIP-on-chip[ред. | ред. код]
Після постановки біологічного питання експеримент ChIP-on-chip можна розділити на три основні етапи: Перший - це налаштування експерименту, а саме: вибір відповідний мікрочіпу та типу зонда. Другий етап - сам експеримент, який проводиться у мокрій лабораторії. Третій етап - суха лабораторія - зібрані даніциклу аналізуються, щоб відповісти на початкове запитання або призвести до нових питань, щоб цикл міг розпочатися заново.
Етап мокрої лабораторії[ред. | ред. код]
На першому етапі білок, що досліджується (POI) зшивається з ДНК-сайтом, з яким він зв'язується в умовах in vitro. Зазвичай це робиться за допомогою слабкої формальдегідної фіксації, яка є зворотнью під дією нагрівання.
Потім клітини лізують і ДНК подрібнюється ультразвуком або за допомогою мікрококкової нуклеази. В результаті отримують фрагменти дволанцюгової ДНК, зазвичай довжиною 1 кб або менше. Ті фрагменти ДНК, які були зшиті з POI, утворюють POI-ДНК-комплекс.
POI-ДНК-комплекси фільтрують із розчину всіх фрагментів ДНК, використовуючи антитіла, специфічні для POI. Антитіла можуть бути прикріплені до твердої поверхні, можуть мати магнітні кульки або якусь іншу фізичну властивість, що дозволяє розділяти зшиті з ними POI-ДНК-комплекси та незв'язані фрагменти ДНК. Ця процедура є по суті імунопреципітацією (ІP) білка.
Далі дволанцюгові фрагменти ДНК очищуються - зшиті POI-ДНК-комплекси зворотні (як правило, нагріванням). Для решти процесу POI більше не потрібен.
Після ампліфікації та денатурації одноланцюгові фрагменти ДНК маркуються флуоресцентною міткою, наприклад Cy5 або Alexa 647.
Нарешті, ДНК заливають на поверхню мікрочіпу ДНК, який містить короткі одноланцюгові послідовності, що охоплюють чатину досліджуванного геному. Щоразу, коли маркований фрагмент "знайде" комплементарний фрагмент на чіпі, вони будуть гібридизуватися та утворюватимуть знову дволанцюжковий фрагмент ДНК.
Етап сухої лабораторії[ред. | ред. код]
Сканування мікрочіпу
Після гібридизації, мікрочіп освітлюється флуоресцентним світлом. Ті зонди на чіпі, які гібридизувались до одного з маркованих флуоресцентною міткою фрагментів ДНК, випромінюють світловий сигнал, який фіксується камерою. Це зображення містить усі необроблені дані для решти процессу. Ці необроблені дані, закодовані псевдо-кольоровим зображенням, і повинні бути конвертовані в числові значення, перш ніж можна зробити власне аналіз.
Аналіз даних
Аналіз та вилучення інформації із необроблених даних часто є найбільш складною частиною експерименту ChIP-on-chip. На цьому етапі виникають різні проблеми починаючи від початкового сканування мікрочіпу, до придатних методів віднімання фонового шуму і, нарешті, до придатних алгоритмів, які нормалізують дані та роблять їх доступними для подальшого статистичного аналізу. Крім того, через різні платформи мікрочіпів та відсутність стандартизації між ними зберігання та обмін даними є величезною проблемою.
Взагалі аналіз даних можна розділити на три основні етапи:
Перший етап - зчитані з мікрочіпу флуоресцентні сигнали нормалізуються, використовуючи контрольні сигнали, отримані з того ж чи іншого мікрочіпу. Такі контрольні сигнали вказують, які зонди на мікрочіпі були гібридизовані правильно, а які - неспецифічно.
На другому етапі застосовуються статистичні тести до контрольних даних та експериментальних даних для ідентифікації областей геному, збагачених POI. Для цього використовуються різні статистичні методи які, як правило, відрізняються тим, як обробляються сигнали низької інтенсивності, як багато сприймається фонового шуму і яка ознака даних виділяється під час обчислення.
На третьому кроці ці ДНК-фрагменти аналізуються далі. Якщо, наприклад, POI був фактором транскрипції, такі ДНК-фрагменти представляли б його сайти зв'язування. Подальший аналіз тоді може зробити висновок про нуклеотидні мотиви та інші паттерни, щоб дозволити функціональну анотацію геному[4].
Переваги та недоліки методу[ред. | ред. код]
Метод ChIP-on-chip забезпечує досить високу роздільну здатність карт повно геному. Ці карти можуть визначити місця зв'язування багатьох ДНК-зв'язуючих білків, таких як фактори транскрипції, а також модифікації хроматину.
Технологія ChIP-on-chip, будучи високопропускною та неупередженою, має ряд істотних переваг. По-перше, метод дозволяє ідентифікувати модифікації гістонів та виявляти непередбачені сайти зв'язування ДНК-зв'язаних білків у розмірі повного геному замість обмеженої кількості геномних локусів, що були задані експериментом. По-друге, технологія ChIP-on-chip має оптимізовану комерційну платформу, і тому це значна економія часу в порівнянні з масштабними кількісними тестами ПЛР. По-третє, паралельний аналіз тисяч генів дозволяє розбивати дані на окремі класи генів на основі різного розподілу зв'язування або поведінки, і дозволяє робити статистичні порівняння між класами[1].
Недоліками ChIP-on-chip є його висока вартість. Більшість опублікованих досліджень, що використовують ChIP-on-chip, повторюють свої експерименти щонайменше три рази, щоб забезпечити біологічно значущі результати. Вартість ДНК-мікрочіпів часто є обмежуючим фактором щодо того, чи слід лабораторії проводити експеримент із застосуванням цього методу. Ще одне обмеження - це розмір фрагментів ДНК для аналізу. Більшість протоколів ChIP-on-chip використовують ультразвук для фрагментування ДНК. Однак ультразвукове подрібнення обмежене мінімальним розміром фрагмента в 200 н.п. Для чіпів з більш високою роздільною здатністю необхідне фрагментування до розмірів одиничної нуклеосоми. Також, статистичний аналіз величезної кількості даних, що утворюються, є досить складним і процедури статистичної нормалізації повинні мініматизувати артефакти та визначати справді біологічно значущі елементи.
Також великим обежуючим фактором для застосування ChIP-on-chip можуть бути антитіла. ChIP-on-chip потребує високоспецифічних антитіл, які повинні розпізнавати його епітоп у розчині, а також у фіксованих умовах. Якщо антитіла успішно імунопреципітують зшитий хроматин, іх називають "ChIP-клас". Компанії, які надають антитіла класу ChIP, включають Abcam, Cell Signaling Technology, Santa Cruz та Upstate. Для подолання проблеми специфічності білок, що представляє інтерес, може бути зшитий з міткою типу FLAG або HA, яка розпізнається антитілами. Альтернативою ChIP-on-chip, який не потребує антитіл, є протокол DamID.
Для дослідження модифікації гістонів доступні антитіла до специфічної модифікації гістону, такі як H3 триметил K4. Як вже згадувалося раніше, поєднання цих антитіл та ChIP-on-chip технології стало надзвичайно потужним інструментом для аналізу повногеномних модифікацій гістонів і має зробити величезний внесок у наше розуміння гістонового коду та епігенетики[5].
Історія[ред. | ред. код]
Перший ChIP-on-chip експеримент був проведений у 1999 році для аналізу розподілу когезину вздовж ІІІ-хромосоми дріжжів[6]. Хоча геном не був повністю проаналізований, протокол у цьому дослідженні залишається аналогічним тому, що застосовувався в наступних дослідженнях. Метод ChIP-on-chip з використанням усіх ORF геному (який все ще залишається неповним, і відсутні інтергенні ділянки) потім був успішно застосований у трьох роботах, опублікованих у 2000 та 2001 роках.[7] [8] [9] Автори визначили місця зв’язування окремих факторів транскрипції в дріжджах Saccharomyces cerevisiae. У 2002 році група Річарда Янга [10] визначила пвногеномні позицій 106 транскрипційних факторів за допомогою системи мічення c-Myc у дріжджах. Про перше застосування методики ChIp-on-chip на ссавцях повідомила лабораторія Пеггі Фарнхем у співпраці з лабораторією Майкла Чжана і опубліковане в 2001 році. [11] З того часу ChIP-on-chip став потужним інструментом визначення повногеномних карт модифікацій гістону та багатьох інших факторів транскрипції. ChIP-on-chip на ссавцях був важким через великі повторювані регіони геному. Таким чином, багато досліджень на клітинах ссавців були зосереджені на промоторних областях, які, як передбачається, зв'язують фактори транскрипції та не аналізували весь геном. Однак, повногеномні мікрочіпи для ссавців стали комерційно доступними у таких компаній, як Nimblegen.
Посилання[ред. | ред. код]
- ↑ а б Liu, Yu; Liao, Jieyue; Lu, Qianjin (2015). Laboratory Methods in Epigenetics. Epigenetics and Dermatology (англ.). Elsevier. с. 7—35. doi:10.1016/b978-0-12-800957-4.00002-3. ISBN 978-0-12-800957-4.
- ↑ Aparicio, Oscar; Geisberg, Joseph V.; Struhl, Kevin (2004-06). Chromatin Immunoprecipitation for Determining the Association of Proteins with Specific Genomic Sequences In Vivo: Determining the Association of Proteins with Specific Genomic Sequences. Current Protocols in Cell Biology (англ.). Т. 23, № 1. с. 17.7.1–17.7.23. doi:10.1002/0471143030.cb1707s23. Процитовано 10 грудня 2019.
- ↑ а б Buck, Michael J; Lieb, Jason D (2004-03). ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments. Genomics. Т. 83, № 3. с. 349—360. doi:10.1016/j.ygeno.2003.11.004. ISSN 0888-7543. Процитовано 10 грудня 2019.
- ↑ Biomedical Genomics Core - The Research Institute at Nationwide Children's Hospital. genomics.nchresearch.org.
- ↑ Li, Xiao-yong; MacArthur, Stewart; Bourgon, Richard; Nix, David; Pollard, Daniel A; Iyer, Venky N; Hechmer, Aaron; Simirenko, Lisa; Stapleton, Mark (12 лютого 2008). Kadonaga, Jim (ред.). Transcription Factors Bind Thousands of Active and Inactive Regions in the Drosophila Blastoderm. PLoS Biology (англ.). Т. 6, № 2. с. e27. doi:10.1371/journal.pbio.0060027. ISSN 1545-7885. PMC 2235902. PMID 18271625. Процитовано 11 грудня 2019.
{{cite news}}: Обслуговування CS1: Сторінки з PMC з іншим форматом (посилання) Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання) - ↑ Blat, Yuval; Kleckner, Nancy (1999-07). Cohesins Bind to Preferential Sites along Yeast Chromosome III, with Differential Regulation along Arms versus the Centric Region. Cell. Т. 98, № 2. с. 249—259. doi:10.1016/s0092-8674(00)81019-3. ISSN 0092-8674. Процитовано 11 грудня 2019.
- ↑ Lieb, Jason D.; Liu, Xiaole; Botstein, David; Brown, Patrick O. (16 липня 2001). Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein–DNA association. Nature Genetics. Т. 28, № 4. с. 327—334. doi:10.1038/ng569. ISSN 1061-4036. Процитовано 11 грудня 2019.
- ↑ Ren, B. (22 грудня 2000). Genome-Wide Location and Function of DNA Binding Proteins. Science. Т. 290, № 5500. с. 2306—2309. doi:10.1126/science.290.5500.2306. ISSN 0036-8075. Процитовано 11 грудня 2019.
- ↑ Iyer, Vishwanath R.; Horak, Christine E.; Scafe, Charles S.; Botstein, David; Snyder, Michael; Brown, Patrick O. (2001-01). Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. Т. 409, № 6819. с. 533—538. doi:10.1038/35054095. ISSN 0028-0836. Процитовано 11 грудня 2019.
- ↑ Lee, T. I. (25 жовтня 2002). Transcriptional Regulatory Networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. Т. 298, № 5594. с. 799—804. doi:10.1126/science.1075090. ISSN 0036-8075. Процитовано 11 грудня 2019.
- ↑ Weinmann, A. S.; Bartley, S. M.; Zhang, T.; Zhang, M. Q.; Farnham, P. J. (15 жовтня 2001). Use of Chromatin Immunoprecipitation To Clone Novel E2F Target Promoters. Molecular and Cellular Biology. Т. 21, № 20. с. 6820—6832. doi:10.1128/mcb.21.20.6820-6832.2001. ISSN 0270-7306. Процитовано 11 грудня 2019.
Додаткова літетура[ред. | ред. код]
- Johnson, W. E.; Li, W.; Meyer, C. A.; Gottardo, R.; Carroll, J. S.; Brown, M.; Liu, X. S. (2006). Model-based analysis of tiling-arrays for ChIP-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33): 12457—12462. Bibcode:2006PNAS..10312457J. doi:10.1073/pnas.0601180103. ISSN 0027-8424. PMC 1567901. PMID 16895995.
- Benoukraf, Touati; Cauchy, Pierre; Fenouil, Romain; Jeanniard, Adrien; Koch, Frederic; Jaeger, Sébastien; Thieffry, Denis; Imbert, Jean; Andrau, Jean-Christophe; Spicuglia, Salvatore; Ferrier, Pierre (2009). CoCAS: a ChIP-on-chip analysis suite. Bioinformatics. 25 (7): 954—955. doi:10.1093/bioinformatics/btp075. ISSN 1460-2059. PMC 2660873. PMID 19193731.
Зовнішні ресурси[ред. | ред. код]
- http://www.genome.gov/10005107 ENCODE project
- Chip-on-Chip (CoC) Package Information from Amkor Technology