Кінетика Міхаеліса — Ментен

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до навігації Перейти до пошуку
Графік залежності початкової швидкості реакції від концентрації субстрату.

Кіне́тика Міхае́ліса — Ме́нтен — у біохімії одна із найпростіших і найвідоміших моделей опису кінетики ферментативних реакцій. Говорять, що фермент слідує кінетиці Міхаеліса-Ментен, якщо для нього характерна гіперболічна залежність початкової швидкості каталізованої реакції (V0) від концентрації субстрату ([S]), що описується рівнянням (рівняння Міхаеліса — Ментен):

,

де Vmax — максимальна швидкість реакції, яка спостерігається тоді, коли фермент повністю насичений субстратом, Km — константа Міхаеліса — концентрація субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальної. Константа Міхаеліса-Ментен має розмірність моль/л і часто використовується для кількісного вираження спорідненості ферменту до субстрату (чим менша Km, тим більша спорідненість), проте таке її трактування не завжди коректне.

Залежність швидкості реакції від концентрацій субстрату[ред. | ред. код]

Одним із основних чинників, які визначають швидкість ферментативної реакції, є концентрація субстрату. Проте в експериментальних умовах вимірювання цієї залежності ускладнюється тим, що концентрація субстрату в ході реакції знижується. Тому для спрощення використовують так звану початкову швидкість V0, яка вимірюється не далі як у перші 60 с реакції, за цей час [S] встигає змінитись всього на кілька відсотків і її можна вважати наближеною до сталої величини. При незмінній концентрації ферменту і відносно невеликій концентрації субстрату швидкість реакції зростає майже лінійно при збільшенні [S] (реакція першого порядку). Проте поступово зростання стає повільнішим, аж поки при певній концентрації субстрату не виходить на плато, тобто спостерігається так званий ефект насичення. Отже після деякого значення [S] швидкість реакції наближається до максимальної Vmax і не змінюється у відповідь на подальше зростання концентрації субстрату.

Виходячи із описаних спостережень, Віктор Генрі 1903 року висловив думку про те, що зв'язування ферменту (E) із субстратом (S) із утворенням фермент-субстратного комплексу є необхідним кроком ензиматичного каталізу. Далі розвинули цю гіпотезу Леонор Міхаеліс та Мод Ментен, які 1913 року постулювали, що першим, зворотним і відносно швидким, етапом реакції є формування фермент-субстратного комплексу (ES), який на другому, повільному, етапі перетворюється у вільний фермент та продукт (P):

. (1)

Оскільки друга стадія є лімітуючою, то загальна швидкість реакції повинна бути пропорційна до концентрації фермент-субстратного комплексу (речовини, що перетворюється на цій стадії).

В будь-який момент часу частина ферменту існує і вільному вигляді, тоді як інша — у зв'язаному із субстратом (ES). Співвідношення між цими двома формами залежить від [S], при малих його значеннях більшість ферменту незв'язана, зростання [S] призводить до зростання [ES] до тих пір, поки всі активні центри молекул ферменту не будуть насичені субстратом. У таких умовах буде спостерігатись максимальна швидкість реакції.

Коли фермент тільки змішується із великою кількістю субстрату, концентрація ES різко зростає, цей період називається престаціонарним і триває кілька мікросекунд, через що його дуже важко спостерігати експериментально. Після цього система досягає стаціонарного стану, при якому швидкість утворення фермент-субстратного комплексу дорівнює швидкості його утворення, тобто [ES] залишається сталою величиною. Концепція стаціонарного стану була вперше запропонована Бріґґсом та Голдейном 1925 року.

Рівняння Міхаеліса-Ментен[ред. | ред. код]

Виходячи із припущення, що лімітуючою стадією ферментативної реакції є розпад фермент-субстратного комплексу на вільний фермент і продукт, Міхаеліс та Ментен вивели рівняння, що описує гіперболічну криву залежності початкової швидкості від концентрації субстрату:

(2)

Наведене рівняння використовують тільки для односубстратних реакцій. Всі величини (V0, Vmax, Km та [S]) можна виміряти експериментально.

Якщо розв'язати наведене рівняння для початкової швидкості реакції рівної половині максимальної , то отримаємо: . Отже константа Міхаеліса — це концентрація субстрату, при якій швидкість дорівнює половині максимальної.

Хоча виведення рівняння Міхеаліса — Ментен було запропоноване для простої двостадійної реакції, насправді його застосування не обмежується тільки ферментами, що діють за таким механізмом. Всі ферменти, для яких початкова швидкість реакції перебуває у гіперболічній залежності від концентрації субстрату, підкоряються кінетиці Міхаеліса — Ментен. Важливий виняток становлять регуляторні ферменти.

Хоча кінетичні константи Km та Vmax легко експериментально визначити для будь-якого ферменту, їхнє фізичне значення може суттєво відрізнятись в залежності від механізму реакції. Ці константи також не дають інформації про кількість, швидкість проходження і хімічну природу окремих кроків реакції.

Експериментальне визначення константи Міхаеліса[ред. | ред. код]

Графік Лайнвівера—Берка (метод подвійних зворотних величин).

Аналіз гіперболи Міхаеліса — Ментен не дає змоги точно експериментально встановити значення Km та Vmax, вони можуть бути оцінені тільки наближено. Тому були запропоновані інші методи обчислення, найпростішим із яких є метод Лайнвівера — Берка або подвійних зворотних величин. Рівняння Лайнвівера — Берка відображає залежність 1/V0 від 1/[S]:

; (12)

Графік цього рівняння відкладається у координатах 1/V0 (вісь ординат) 1/[S] (вісь абсцис) і є лінійним. Він дозволяє легко отримати значення кінетичних констант Vmax (перетин графіка із віссю 1/V0 відповідає точці 1/Vmax) та Km (перетин графіка із віссю 1/[S] відповідає точці -1/ Km). Тангенс кута нахилу прямої становить Km/Vmax. Отримані значення будуть досить неточними, оскільки обернені графіки типу Лайнівера — Берка візуально спотворюють значення похибок вимірювань, тому в сучасних обчисленнях використовують частіше чисельні методи нелінійної регресії для прямого рівняння Міхаеліса — Ментен.

Інтерпретація кінетичних констант[ред. | ред. код]

Константа Міхаеліса[ред. | ред. код]

Значення константи Міхаеліса суттєво відрізняється для різних ферментів і навіть для різних субстратів того ж ферменту. Часто, і зазвичай помилково, його трактують як кількісну міру спорідненості ферменту до субстрату. Справжнє фізичне значення константи Міхаеліса залежить від конкретного механізму реакції (кількості етапів і відносної швидкості кожного із них). Спорідненість ферменту до субстрату характеризує константа дисоціації або субстратна константа:

(13)

Константа ж Міхаеліса визначається так:

(14)

Отже вона буде наближатись до значення субстратної константи тільки у тому випадку, коли k−1 >> k+2. Тобто Km є мірою спорідненості ферменту до субстрату тільки тоді, коли швидкість розпаду фермент-субстратного комплексу на фермент та субстрат значно переважає швидкість його розпаду на фермент і продукт. Проте в багатьох випадках k−1 << k+2 або обидві константи приблизно рівні. Навіть частіше спостерігається ситуація, коли за утворенням фермент-субстратного комплексу слідує ще серія послідовних перетворень, тоді константа Міхаеліса стає складною функцією багатьох констант швидкості.

Експериментально встановлено, що значення Km зазвичай близьке до реальної концентрації субстрату в клітині.

Максимальна швидкість і число обертів[ред. | ред. код]

Максимальна швидкість реакції визначається як у випадку, коли етап розпаду фермнет-субстратного комплексу на вільний фермент та продукт є лімітуючим. Проте багато кількастадійних реакцій можуть обмежуватись якимось іншим етапом. Тому зручно ввести загальну константу швидкості kcat, що описує лімітуючу стадію або стадії реакції. Наприклад для реакції (1) kcat = k+2. В загальному випадку , тоді рівняння Міхаеліса — Ментен модифікується так:

(15)

Константа kcat має розмірність с−1 і також називається числом обертів ферменту. Вона означає кількість молекул субстрату, що перетворюються однією молекулою ферменту за певну одиницю часу в умовах насичення ферменту субстратом.

Порівняння ефективності каталізу[ред. | ред. код]

Кінетичні константи Km та kcat дозволяють оцінювати ефективність каталізу певного ферменту, проте кожного з них окремо не достатньо для цього завдання. Наприклад два ферменти, що каталізують різні реакції, можуть мати однакове значення kcat, проте міра в якій вони пришвидшують відповідні реакції, може різнитись, через те, що самі реакції за відсутності ферментів можуть протікати з різною швидкістю.

Для максимально точного порівняння каталітичної ефективності різних ферментів (або одного ферменту по відношенню до різних субстратів) використовують співвідношення kcat/Km, яке ще називається константою специфічності. Це константа для перетворення E + S → E + P. Коли [S] << Km, то рівняння (15) перетворюється таким чином:

(16)

kcat/Km у цьому рівнянні є константою другого порядку (вимірюється у л/моль·с або М−1·c−1). Для випадку розглянутого у виведенні рівняння Міхаеліса-Ментен враховуючи визначення константи Міхаеліса із (14):

(17)

Отже константа специфічності буде найбільшою, коли k+2 >> k−1, тобто, коли швидкість розпаду фермнет-субстратного комплексу із утворенням продукту значно переважає над швидкістю зворотної дисоціації до вільного ферменту та субстрату. В такому випадку kcat/Km = k+1. Максимальне значення k+1 (константи другого порядку для реакції утворення фермент-субстратного комплексу) обмежене швидкістю взаємної дифузії ферменту та субстрату, тобто найбільшою кількістю разів, які вони можуть стикатись в розчині. Ця межа контрольована дифузією становить 108 М−1·c−1 — 109 М−1·c−1. Деякі ферменти, наприклад супероксиддисмутаза, каталаза, фумараза та інші, досягнули так званої каталітичної досконалості, тобто вони каталізують реакцію фактично кожен раз, коли зустрічаються із субстратом, а kcat/Km для них лежить у межах 108 М−1·c−1 — 109 М−1·c−1.

Значення Km, kcat та kcat/Km для деяких ферментів[1][2]
Фермент Субстрат Km, (моль/л) kcat (c−1) kcat/Km−1·c−1)
Ацетилхолінестераза Ацетилхолін 9,5 × 10−5 1,4 × 104 1,5 × 108
Карбоангідраза CO2 1,2 × 10−2 1,0 × 106 8,3 × 107
HCO-3 2,6 × 10−2 4,0 × 105 1,5 × 107
Каталаза H2O2 2,5 × 10−2 1,0 × 107 4,0 × 108
Хімотрипсин N-Ацетилгліцин етиловий естер 4,4 × 10−1 5,1 × 10−2 1,2 × 10−1
N-Ацетилвалін етиловий естер 8,8 × 10−2 1,7 × 10−1 1,9
N-Ацетилтирозин етиловий естер 6,6 × 10−4 1,9 × 102 2,9 × 105
Фумараза Фумарат 5,0 × 10−6 8,0 × 102 1,6 × 108
Малат 2,5 × 10−5 9,0 × 102 3,6 × 107
Супероксиддисмутаза Супероксидний аніон (O2-) 3,6 × 10−4 1,0 × 106 2,8 × 109
Уреаза Сечовина 2,5 × 10−2 1,0 × 104 4,0 × 105
β-Лактамаза Бензилпеніцилін 2,0 × 10−5 2,0 × 103 1,0 × 108

Світлим кольором виділені ферменти із значенням kcat/Km близьким до межі, що визначається дифузією.

Примітки[ред. | ред. код]

  1. Voet et al, 2011, с. 489.
  2. Nelson et al, 2008, с. 199.

Джерела[ред. | ред. код]