Нокдаун гена
Нокдаун гена — метод в експериментальній біології, завдяки якому досягається постійна або тимчасова зупинка експресії певного гену. Цього можна досягти або шляхом генетичної модифікації організму, або застосуванням певних хімічних сполук, а саме коротких ДНК або РНК (олігонуклеотидів), які зазвичай споріднені до мРНК гену, який потрібно вимкнути[1].
Якщо нокдаун гена досягнуто завдяки змінам в ДНК організму методами генної інженерії, утворений лабораторний організм зазвичай називають «нокдаун-організмом» (англ. «knockdown organism»). Якщо рівень експресії певного гена тимчасово змінений додаванням олігонуклеотидних реагентів, які діють на мРНК без змін на генному рівні, йдеться про тимчасовий нокдаун (англ. «transient knockdown»)[1].
Під час тимчасового нокдауну олігонуклеотидні реагенти зв'язуються або безпосередньо з цільовим геном, або з його мРНК-транскриптом, і врешті-решт впливають на кількість кінцевого продукту експресії цього гену завдяки різним молекулярним механізмам. Такими механізмами є, наприклад, блокування транскрипції, деградація мРНК (завдяки міРНК), блокування сплайсингу і трансляції мРНК тощо[1][2].
Найбільш важливою галуззю застосування тимчасового нокдауну є вивчення функції нових генів. Для генів із відомою нуклеотидною послідовністю і невідомою функцією тимчасовий нокдаун дає змогу визначити їх роль за змінами, що відбуваються в клітині або організмі. Такий експериментальний підхід отримав назву зворотна генетика. Він особливо популярний в біології розвитку[3].
РНК-інтерференція дає змогу вимкнути експресію певного гена шляхом деградації мРНК[4]. Нокдаун гена у цьому випадку досягається введенням в клітину малих дволанцюгових інтерферуючих РНК (міРНК). Малі інтерферуючі РНК можуть утворюватись всередині клітини з ендогенних РНК, а можуть бути введені ззовні. Після введення в клітину міРНК сприятимуть деградації цільової мРНК шляхом залучення RISC-комплексу та рибонуклеаз[5].
РНК-інтерференція широко використовується в біологічних лабораторіях для вивчення функцій генів[6]. РНК-інтерференція в таких модельних організмах як нематода C. elegans і фруктова муха D. melanogaster дозволяє дуже швидко дізнатись, яку саме роль виконує той чи інший ген із відомою нуклеотидною послідовністю. Дослідження функцій генів за допомогою РНК-інтерференції може бути автоматизоване і проводитись паралельно для великої кількості генних послідовностей — так званий РНКі-скринінг)[7][8].
Інший експериментальний підхід до нокдауну генів базується на бактеріальній системі CRISPR.[9] Протеїни, закодовані в CRISPR-асоційованих генах (cas-генах), розпізнають ендогенну ДНК, фрагментують її та зберігають у CRISPR-локусі. Коли кластер CRISPR експресується в клітині, короткі РНК-фрагменти, що врешті утворюються, слугують як матриці для Cas-білків для дезактивації ДНК з ідентичними послідовностями. Ця система, яка в природі є своєрідною імунною системою бактерій, була перенесена біологами в інші організми й перепрограмована для керованих маніпуляцій (розрізання) з ДНК різних організмів. Системи на основі CRISPR були застосовані в людських клітинах[10], бактеріях[11], C. elegans[12], рибах[13] та інших модельних організмах задля маніпуляції з геномами. Системи на основі CRISPR дозволяють отримати широке розмаїття нокдаун-організмів.
Нокдаун-організми були спочатку розроблені для фундаментальних досліджень. Вони особливо цінні у дослідженнях багатоклітинних модельних організмів, таких як миші, коли тимчасовий нокдаун шляхом введення РНК-олігонуклеотидів не може бути ефективно досягнутий[3][14].
Згодом нокдаун-організми стали комерційно доступними для різних задач, головним чином для медичних досліджень. Наприклад, генетично-модифіковані миші із нокдауном гена-супресора пухлин використовуються в дослідження ракових пухлин.
- 1 2 3 Summerton, James E. Morpholino, siRNA, and S-DNA Compared: Impact of Structure and Mechanism of Action on Off-Target Effects and Sequence Specificity. Current Topics in Medicinal Chemistry (англ.). 7 (7): 651—660. doi:10.2174/156802607780487740.
- ↑ Summerton, James (1999). Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression (англ.). 1489 (1): 141—158. doi:10.1016/S0167-4781(99)00150-5.
- 1 2 Nasevicius, Aidas; Ekker, Stephen C. (2000). Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics (англ.). 26 (2): 216—220. doi:10.1038/79951. ISSN 1061-4036.
- ↑ Fire, Andrew; Xu, SiQun; Montgomery, Mary K.; Kostas, Steven A.; Driver, Samuel E.; Mello, Craig C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature (англ.). 391 (6669): 806—811. doi:10.1038/35888. ISSN 0028-0836.
- ↑ Pratt, Ashley J.; MacRae, Ian J. (2009–07). The RNA-induced Silencing Complex: A Versatile Gene-silencing Machine. Journal of Biological Chemistry (англ.). 284 (27): 17897—17901. doi:10.1074/jbc.R900012200. PMC 2709356. PMID 19342379.
{{cite journal}}: Обслуговування CS1: Сторінки з неправильним форматом в діапазонах дат (посилання) - ↑ Fraser, Andrew G.; Kamath, Ravi S.; Zipperlen, Peder; Martinez-Campos, Maruxa; Sohrmann, Marc; Ahringer, Julie (2000). Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature (англ.). 408 (6810): 325—330. doi:10.1038/35042517. ISSN 0028-0836.
- ↑ Kamath, R (2003). Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (англ.). 30 (4): 313—321. doi:10.1016/S1046-2023(03)00050-1.
- ↑ Ghadakzadeh, S., Mekhail, M., Aoude, A., Hamdy, R. and Tabrizian, M. (2016), Small Players Ruling the Hard Game: siRNA in Bone Regeneration.
- ↑ Gilbert, Luke A.; Larson, Matthew H.; Morsut, Leonardo; Liu, Zairan; Brar, Gloria A.; Torres, Sandra E.; Stern-Ginossar, Noam; Brandman, Onn; Whitehead, Evan H. (2013). CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell (англ.). 154 (2): 442—451. doi:10.1016/j.cell.2013.06.044. PMC 3770145. PMID 23849981.
- ↑ Esvelt, Kevin M; Mali, Prashant; Braff, Jonathan L; Moosburner, Mark; Yaung, Stephanie J; Church, George M (2013). Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods (англ.). 10 (11): 1116—1121. doi:10.1038/nmeth.2681. ISSN 1548-7091. PMC 3844869. PMID 24076762.
- ↑ Jiang, Wenyan; Bikard, David; Cox, David; Zhang, Feng; Marraffini, Luciano A (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology (англ.). 31 (3): 233—239. doi:10.1038/nbt.2508. ISSN 1087-0156. PMC 3748948. PMID 23360965.
- ↑ Chen, Changchun; Fenk, Lorenz A.; de Bono, Mario (2013). Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research (англ.). 41 (20): e193—e193. doi:10.1093/nar/gkt805. ISSN 1362-4962. PMC 3814388. PMID 24013562.
- ↑ Hisano, Yu; Ota, Satoshi; Kawahara, Atsuo (2014). Genome editing using artificial site‐specific nucleases in zebrafish. Development, Growth & Differentiation (англ.). 56 (1): 26—33. doi:10.1111/dgd.12094. ISSN 0012-1592.
- ↑ Adenoviral Gene Knockdown Cells. Sirion Biotech. Архів оригіналу за 9 липня 2013. Процитовано 17 квітня 2013.