Флуоресценція в біологічних дослідженнях

Флуоресценція, або фотолюмінісценція, це фізичне явище яке знайшло широке застосування у різноманітних прикладних біологічних дослідженнях. Його суть полягає у короткочасному поглинанні кванта світла флуорофором (речовиною що здатна флуоресціювати) із наступним випроміненням іншого кванта, що має властивості відмінні від вихідного. Багато напрямків у біофізиці, молекулярній та клітинній біології виникли та розвиваються саме завдяки впровадженню нових методів що базуються на флуоресценції.

Поєднання флуоресцентної детекції із методом секвенування ДНК за Сангером у другій половині 1980-х набагато підвищило гнучкість та ефективність цього методу та дозволило реалізувати його автоматизацію. Це відкривало технічну можливість проведення високошвидкісного секвенування і дозволило розпочати проект "Геном людини" на початку 1990-х років. Флуоресцентна детекція також знайшла використання у ще більш ефективних методах секвенування наступних поколінь.

Флуоресценція повністю змінила вигляд клітинної біології. Розробка нових інструментальних методів (конфокалька флуоресцентна мікроскопія) із новими біохімічними методами (іммунфлуоресцентне забарвлення зразків, генетична інженерія флуоресцентних білків) дала початок ефективному дослідженню живих обєктів на клітинному рівні.

Наразі найважливішою галуззю застосування флуоресцентних методів є клінічна діагностика. Поєднання спеціально розроблених флуоресцентних зондів із полімеразною ціпною реакцією дало початок великій кількості нових методів кількісного ПЦР, які використовуються для діагностики генетичних захворювань або ідентифікації патогенних мікроорганізмів.

Великі зусилля прикладаються для розробки методів флуоресцентних методів діагностики in vivo. Наприклад, нещодавно створені методи які дозволяють за допомогою флуоресцентних зондів виявляти злоякісні пухлини під час ендоскопічного обстеження або томографії. Також активно розробляється метод "підсвічення ракових пухлин" флуоресценцією в ближньому інфрачервоному світлі для більш точного хірургічного видалення (image-guided surgery).

Фізичні основи флуоресценції

Флуоресценція це одне з явищ які відбуваються при взаємодії електромагнітного випромінення з речовиною. Флуоресценція пов'язана з електронними переходами у молекулі флуорофору. Послідовність подій що передують флуоресцентному випроміненню для простого органічного флуорофору спрощено зображена на малюнку.

Послідовність подій що передують флуоресценції

За нормальних умов переважна більшість молекул флуорофору перебувають у основному електронному стані. При наявності кванта електромагнітного випромінення відповідної енергії відбувається його поглинання системою з конверсією системи у збуджений стан. В цей момент відбувається перехід електрона з найвищої зайнятої на найнижчу вільну молекулярну орбіталь. В молекулярній спектроскопії прийнято позначати стани відповідно для їх мультиплетності, яка залежить від сукупного спіну системи і розраховується за формулою 2*спін+1. В нейтральних органічних молекулах всі електрони парні, тобто загальний спін системи дорівнює нулю. Відповідно мультиплетність буде дорівнювати одиниці. Через це такі основні стани прийнято називати синглетними (від англ. single) та позначати буквою S. Індексами 0 та 1 позначаються основний та збуджений стани, відповідно.

Електронне збудження в більшості органічних молекул викликається електромагнітним випроміненням з енергією 2 - 3.5 електрон-вольт. Тобто видимим світлом (довжина хвилі > 400 нм) та ближнім ультрафіолетом (довжина хвилі 300-400 нм). Окремі сполуки можуть збуджуватись червоним та ближнім інфрачервоним світлом.

При поглинанні світла відповідної енергії флуорофором відбувається перехід у збуджений стан $~S_{0}\rightarrow S_{1}$. Цей процес дуже швидкий, і відбувається приблизно за 10^-12 секунд. Певний час молекула флуорофору може існувати у збудженому стані. Для простих органічних барвників цей час складає приблизно декілька наносекунд (10^-9 с). Після цього молекула випромінює інший квант світла, повертаючись у основний електронний стан: $~S_{1}\rightarrow S_{0}$. Як правило, поглинений та випромінений кванти значно розрізняються за енергіями через втрати енергії під час релаксації збудженого стану.

Флуоресценцію слід відрізняти від інших видів люмінісценції, таких як фосфоресценція, хемолюмінісценія та біолюмінісценція.

У найпростішому випадку для спостереження флуоресценції сполуки потрібно лише відповідне джерело збуджуючого світла, такого як наприклад довгохвильова ультрафіолетова лампа, як на малюнку ліворуч. На фотографії зображений розчин перилену у органічному розчиннику під час опромінення довгими ультрафіолетовими хвилями.

Для вивчення флуоресценції в лабораторних умовах використовують більш складні прилади. Спрощена схема найбільш поширеного типу спектрофлуориметрів показана на малюнку праворуч.

В спектрофлуориметрах використовують різноманітні джерела збуджуючого світла, найчастіше ксенонові лампи високого тиску. Світло від лампи поступає в монохроматор збудження, який дає на виході світло з певною потрібною довжиною хвилі $~\lambda _{ex}$. Цей монохроматичний промінь направляється на зразок, викликаючи флуоресценцію. Важливим є те що флуоресцентна емісія ізотропна, тобто її інтенсивність однакова по всих напрямках і не залежить від кута під яким вона спостерігається. Це дає можливість легко відділити її від збуджуючого проміня. Розташування вікна детекції під кутом 90° до напрямку збудження дає можливість вловлювати виключно ті фотони, які є результатом флуоресцентної емісії. Флуоресцентне світло пропускається крізь ще один монохроматор (монохроматор еміссії), залишаючи світло тільки певної потрібної довжини хвилі $~\lambda _{em}$. Після цього інтенсивність світлового потоку вимірюється за допомогою детектора. Перераховані тут компоненти (джерело світла, монохроматори, детектор) в різних варіантах і комбінаціях присутні у всих приладах які вимірюють флуоресценцію.

Характеристики флуоресценції

При роботі із флуоресцентними сполуками необхідно оперувати кількісними показниками, які характеризують флуоресцентну емісію. Найважливіші з них наведені у таблиці.

Праметер	Позначення	Опис
Інтенсивність флуоресценції	$~\mathrm {I} _{F}$	Цей парамер пропорційний кількості фотонів, які досягають детектора в одиницю часу. Часто вимірються в кількості фотонів на секунду (cps, counts per second), або у відносних одиницях (A.U., arbitrary units).
Спектр флуоресценції	$~\mathrm {I} _{F}=f(\lambda _{em})$	Спектр записаний при сталому значенні довжини хвилі збудження.
Спектр збудження	$~\mathrm {I} _{F}=f(\lambda _{ex})$	Спектр записаний при сталому значенні хвилі емісії
Час життя	$~\tau _{F}$	Для кожної флуоресцентної сполуки можна виміряти величину, що має назву "час життя флуоресценції. Ця величана має порядок близько наносекунд (для органічних флуорофорів). Вона показує усереднений час існування збудженого стану. Якщо побудувати графік затухання флуоресценції у часі, він буде мати вигляд екпоненційної кривої. У найпростішому випадку спадання буде моноекспоненційним, тобто буде мати вигляд прямої у логарифмічних кординатах. Для більшості органічних барвників час життя флуоресценції складатиме від долей до декількох наносекунд. Для флуоресцентних нанокристалів час життя флуоресценції може досягати десятків наносекунд. Нарешті для окремих комплексів металів може спостерігатися наддовга флуоресценції, із часом життя у декілька мікросекунд. Слід розуміти що час життя в 1 нс не означає що флуоресценція зникне за одну наносекунду. Ця величина означає середній час існування збудженого флуорофору у великій популяції. Кожна окрмо взята молекула може випромінити фотон за час як коротший, так і довший $~\tau _{F}$.
Квантовий вихід флуоресценції	$\Phi ={\frac {N_{em}}{N_{abs}}}$	Показує яка частка поглинутих фотонів випромінюється у вигляді флуоресценції. Оскільки флуоресценція є ймовірностним процесом, невідомо які саме флуорофори з великої популяції завершать життя флуоресценцією, а які з них завершать існування іншим шляхом. Квантовий вихід показує ймовірність флуоресценції окрмо взятого флуорофора. Часто вимірювання квантового виходу проводять порівнюючи кількість фотонів яка випромінюється зразком із стандартною речовиною, наприклад з сульфатом хініну, для якого Ф = 0.56.
Фотостабільність		Показує наскільки швидко руйнується сполука під дією збуджуючого випромінення.

Суміжні явища важливі для біологічних застосувань

Деякі явища знайшли надають можливість для додаткової модифікації експерименту, що надалі дає додаткову інформацію про оточення флуорофора.

Явище	Пояснення
Анізотропія флуоресценції	Показує наскільки змінюється орієнтація збуджених молекул за час існування збудженого стану. Для вимірювання анізотропії флуоресценції необхідні прилади з поляризаторами збуджуючого і флуоресцентного свіла. Знаючи інтенсивність паралельної та перпендикулярної фракції світла, анізотропію можна розрахувати за формулою: $r={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{\parallel }+{2I_{\perp }}}}$ Анізотропія флуоресценції показує, наскількі вільно обертається молекула за час існування збудженого стану. Вільні флуорофори у розчинах за нормальних умов рухаються вільно, що викликає швидку деполяризацію (r = 0). Якщо флуорофор привязаних до великої біомолекули, такої як білкова глобула, вільних рух заблокований, що призводить для високих значень поляризації (теоретично можливий максимум r = 0.4). Анізотропія флуоресценції широко використовується для вивчення асоціації біомолекул.
Гасіння флуоресценції	Інколи інтенсивність флуоресценції суттєво зменшується за наявності певних сполук в розчині. Таке явище називається гасінням флуоресценції, а сполуки що його викликають - гасниками (англ.quencher) Класичним прикладом є кисень, який є гасником для великої кількості органічних флуорофорів. Математично гасіння флуоресценції описується рівнянням Штерна-Вольмера. ${\frac {F_{0}}{F}}=1+k_{sv}\cdot [\mathrm {Q} ]$ Тут $~F_{0}/F$ - відношення початкової флуоресценції до флуоресценції в присутності гасника; $~k_{SV}$ - константа Штерна-Вольмера; $~[Q]$ - концентрація гасника. В координатах які показують залежність $~F_{0}/F$ від концентації гасника спостерігається пряма лінія. Гасіння буває статичним і динамічним. При статичному гасінні флуорофор у основному електронному стані утворює нефлуоресцентний комплекс з гасником. При динамічному гасінні утворюється звичайний збуджений стан, який руйнується гасником ще до того як встигає відбутись флуоресцентна еміссія. Обидва види гасіння використовуються при розробці флуоресцентних зондів.
FRET - Фёстерівський переніс резонансної енергії	Фёстерівський переніс резонансної енергії (FRET) - процес у якому приймає участь два флуорофори, донор (D) і акцептор (A) переносу. Під час ФРЕТ відбувається перенесення енергії від одного флуорофору до іншого. Тобто збуджуючи одну молекулу (донор), можна спостерігати фулоресценцію він іншої (акцептора). Fret - emission spectra scheme.svg Для ФРЕТ необхідно дотримання декількох умов, а саме: спектр флуоресценції донора має перекриватись зі спектром флуоресценції акцептору; донор і акцептор мають знаходитись на певній відстані одне від одного. дипольні моменти донора і акцептора мають мати певне сприятливе розміщення у просторі. Важливим є те, що ФРЕТ відбувається на відстанях сумірних з розмірами так біологічних обєктів як білкові глобули або мембрани. Через його залежність від відстані ФРЕТ став своєрідною "молекулярною лінійкою", яка дозволяє прямо вимірювати відстані між різними молекулами. Якщо дві молекули що мічені ФРЕТ-парою знаходяться на великій відстані, при збудженні донора буде спостерігатись тільки його власна флуоресцецнція. У випадку коли молекули зближуються, при збудженні донора буде спостерігатись емісія акцептора. Ефективність ФРЕТ можна розрахувати за формулою. $~E={\frac {R_{0}^{6}}{R_{0}^{6}+r^{6}}}$ тут R0 є Фьостерівським радіусом, такою відстанню між донором та акцептором, при якій ефективність переносу дорівнює 0.5.

Переваги флуоресцентних методів досліджень

Флуоресценція надає суттєві переваги порівняно з іншими методами досліджень.

• Надвисока чутливість - за допомогую сучасного обладнання можна впевнено ідентифікувати окремі флуоресцентні молекули, що дуже важливо для вивчення біологічних систем на молекулярному рівні.

• Мультиплексність детекції - флуоресценція може бути різнокольоровую, що дозволяю детектувати багато сполук закодованих різними кольорами. Цим вона вигідно відрізняється від інших технік, таких як радіоктивне мічення. Наприклад, можливо детектувати пять різних сполук на одному і томому самому зображенні клітини.

• Неінвазивність - сумісність з живими системами. В багатьох випадках можливо проводити дослідження на живих клітинах.

• Висока швидкість відповіді - флуоресценція відбувається у наносекундній шкалі часу (у випадку окремих комплексів металів - у мікросекундній). Це дає можливість спостерігати за дуже швидикими процесами в реальному часі.

• Високе просторове розділення - можливість розрізняти обєкти що знаходяться на відстані декількох десятків нанометрів.

Флуорофори

Малі органічні сполуки

Переважна більшість флуоресцентних речовин які використовуються в біологічних дослідженнях є малими органічними сполуками. Тобто органічними речовинами чітко визначеної будови та з молекулярною масою в межах одного кілодальтона. Явище флуоресценції вперше спостерігалось для сульфату хініну, рослинного алкалоїду що міститься в тоніку.

Флуоресцентними властивостями володіє надзвичайно велика кількість органічних сполук. Практичне значення мають лише обмежена кількість сполук, які є похідними небагатьох базових структур. Класичними органічними барвниками є похідні кумарину, флуоресцеїну, родаміну, BODIPY та ціанінові барвники.

Важливої особливістю цих сполук є те що колір флуоресценції можна змінювати варіюючи замісники у базоваму ядрі.

Файл:Флуоресцентні барвники різної хімічної природи.png

Флуоресцентні спектри барвників різної хімічної природи

Іншою їх особливістю є те, що можна керувати флуоресценцією цих сполук, змінюючи природу хімічних груп.

Існують комерційні набори барвників, такі як Атто або Алекса.

Хоча органічні флуорофори мають певні обмеження, основним з яких є висока фотодеградація, вони і досі знаходять широке застосування у різних галузях. Наразі ведеться велика робота із синтезу нових органічних флуорофорів з покращеними властивостями.

Флуоресцентні білки

Цікавою групою флуорофорів які були знайдені в живій природі є флуоресцентні білки. Перший представник цього класу був виділений з медузи Aequorea victoria ще в 1962 році. Довгий час час ця робота залишалася незатребуваною, аж поки в 1990-х роках не почалося інтенсивне використання зеленого флуоресцентного білку в молекулярній та клітинній біології.

Зясувалось, що якщо методами генної інженерії вставити ген GFP в інші організми, можна досягти значного рівня експресії і відповідно створювати нові флуоресцентні організми.

• 
  Медуза Aequorea victoria з якої вперше було виділено зелений флуоресцентний білок, родоначальник виликої родини флуоресцентних білків
• Тривимірна структура зеленого флуоресцентного білка та хімічна структура його флуорофору
  Тривимірна структура зеленого флуоресцентного білка та хімічна структура його флуорофору
• 
  Чашка Петрі з бактеріями що експресують 8 різних типів флуоресцентних білків.

Великою вдачею є те що перетворення GFP з поліпептидного ланцюга на функціональний білок відбувається спонтанно за фізіологічних умов, за участі кисню як єдиного кофактору.

Точковий мутагенез зеленого GFP дозволив створювати чисельні мутанти з покращеними властивостями. Наприклад, зміна окремих амінокислот як з оточення флуорофору, так і з переферійних областей протеіну, дала чисельні мутанти зі зміненими кольорами флуоресценції (синім, жовтим, червоним та навіть інфрачервоним) Також за допомогою направленої розробки вдалося отримати варіанти із більш швидким дозріванням, меншою слильністю до олігомеризації, а також з вищою фотостабільністю. Також існує група флуоресцентних білків які можна "включати" та "вилючати" опроміненням лазером певного кольору.

Революційне значення флуоресцентних білків для сучасної біохімії та біології було відзначено Нобелівською премією 2008 року.

Флуоресцентні наночастинки і нанокластери

Флуоресцентні точки різних розмірів. Діаметер збільшується у напрямку зліва направо

Особливу групу флуоресцентних емітерів складають напівпровідникові нанокристали, або квантові точки (англ. Quantum dots). Нанометрові частинки таких речовин як наприклад селенід кадмію здатні поглинати світло та флуоресціювати. При зменшенні фізичних розмірів частинки наповпровідника до розмірів співрозмірних з дебройлівською довжиною хвилі для електрону вони починають проявляти властивості відмінні від обємних напівпровідників. При взаємодії квантової точки з електромагнітним світлом утворюється екситон замкнений у потенційній ямі. Рекомбінація екситону призводить до флуоресцентної емісії.

Через відмінність в хімічній будові та природу основного та збудженого електронного стану, флуоресцентні властивості квантових точок відрізняються від властивостей органічних флуорофорів та флуоресцентних білків. По-перше, квантові точки дають вузький та симетричний спектр емісії, положення максимума якого залежить від діаметру та метіріалу квантової точки. Якщо варіювати концентрацію реагентів при синтезі, можна досягти утворення переважного формування квантових точок переважно одного діаметру, які будуть мати свій специфічний колір флуоресценції. Так, наприклад для CdSe зміна розміру ядра від 13 до 24 нанометрів призводить до зміни флуоресценції від блакитної (λ_em = 500 нм) до червоної (λ_em = 610 нм). Важливим є те, що вигляд спектра збудження флуоресценції не залежить від діаметру; це означає що можна досягти одночасного збудження багатьох різних квантових точок використовуючи лише одну хвилю збудження. Це дуже зручно для використання у флуоресцентній мікроскопії, де постійне переключення між різними джерелами збудження зменшує часове розділення методу.

Іншою перевагою квантових точок над органічними флуоресцентними барвниками є високі квантові виходи флуоресценції та надзвичайно висока фотостабільність.

У той же час, квантові точки мають і ряд недоліків. По-перше, це їхні великі розміри, що перевищують величину більшості біологічних молекул. По-друге, матеріали з яких виготовляються квантові точки (Cd, Pb, Se, Hg) є дуже токсичними для біологічних систем. Для обходження останнього зараз застосовується багатоступеневий дизайн квантових точок, коли напівпровідникове ядро (core) покривається подвійною захисною оболонкою із спорідненого метеріалу (для селеніду кадмію таким матеріалом є сульфід цинку) та гідрофільною полімерною оболонкою, яка збільшує розчинність квантової точки у водному середовищі та дає можливість хімічно привязувати до поверхні інші молекули.

Квантові точки широко використовуються у флуоресцентній мікроскопії та молекулярній діагностиці in vitro; також розробляються методи для використання їх у молекулярному імейджингу та діагностиці in vivo.

Існують інші флуоресцентні матеріали нанометрових розмірів. Наприклад, кремнієві наночастинки із привязаними до поверхні органічними барвниками які мають суттєво нижчу токсичність порівняно із квантовими точками. Іншим прикладом є срібні нанокластери синтезовані на матриці з ДНК, які демонструють флуоресценцтні властивості скаладаючись при цьому всього з кількох атомів металу.

Власна флуоресценція біологічних обєктів

Важливими флуорофорами є амінокислоти триптофан та тирозин.

Складові компоненти ДНК і РНК не флуоресціюють. Відбувається надшвидка деактивація збудженого стану. Існує гіпотеза, що нефлуоресцентість цих молекул є важливою для зберігання генетичної інформації.

Тканини живих обєктів здатні флуоресціювати. Це явище називається автофлуоресценцією.

Синтетичні аналоги нефлуоресцентних біомолекул

Існує багато флуоресцентних аналогів біологічних макромолекул. Прикладами є аденін та 2-амінопурин.

Флуоресенція в біології: зонди та мітки

У якості розпізнавального елементу можна використовувати аптамери.

Методи введення зондів та міток в біологічні системи

Нековалентне мічення

Варіантом нековалентного мічення можна вважати імунофлуоресцентні методи.

Приклади використання флуоресценції

Флуоресценція у дослідженні нуклеїнових кислот

Флуоресцентні барвники для днк та рнк

Існує декілька моделей для взаємодії флуорофорів з ДНК.

Бромід етидію.

Hoechst 33342 DAPI YOYO-1 Thiazole Orange TOTO-1

Бібліографія

• Joseph R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy. — Springer, 2006.