Користувач:Loteralle/пісочниця

ЯМР-спектроскопі́я білкі́в — метод структурної біології, в якому ЯМР-спектроскопія використовується для отримання інформації про структуру і динаміку білків

Значення

Метод був ЯМР спектроскопії був розвинутий для застосування з біолічними макромолекулами, серед інших, швейцарськими дослідниками Ріхардом Ернстом та Куртом Вуртріхом , які були відзначенні Нобелівською премію з хімії 1991 та 2002 року відповідно. ЯМР є універсальним і важливим інструментом у сучасній біомолекулярній науці , здатний давати інформацією про структуру, динаміку і взаємодії білків та нуклеінових кислот та їх лігандів . ЯМР-спектроскопія та рентгенівська кристалографія зараз є єдиними методами , які можуть визначати структуру білків з атомним дозволом. На відміну від рентгенівської кристалографії , ЯМР високого дозволу має можливість вивчати біомолекул в більш природньмоу розчинному середовищі і не вимагає кристалізації. В даний час отриманная структури білків вагою до ~ 25 кДа є рутинною процедурою. Основним лімітуючим фактором спектроскопії ЯМР є принціпіально властива їй низька чутливість та ускладнення спектру з ростом молекулярної маси біомолекули . Як наслідок , розмір білків , які можуть бути вивчені з атомним дозволом, є обмеженим. З розвитком спектрометрів з сильнішими магнітами , кращих зондів і нових спектроскопічних методів, стало можливим дослідження білків з масою до 80 кДа (Тугарінов та ін., 2005). ЯМР може також бути корисним і для більших білкових комплексів, особливо при поєднані структурних даних низького дозволу з іншими методами , такими як рентгенівське розсіювання під малими кутами en:SAXS ( Sunnerhagen та ін, 1996; Гришаєв та ін, 2005 , 2008 ; Wang та ін , 2009). ЯМР також дозволяє досліджувати нестаціонарні процеси, такі як кінетика ферментів (Henzler-Уайлдман та ін, 2007.) та внутрішньомолекулярну динаміку (Ішима і Torchia, 2000; Palmer, 2004). Визначення структури білків за допомогою ЯМР високого дозволу почалося з появою двовимірної спектроскопії на початку 1980-х. Перші двомірні технікі, які в данний час об'єднуть під назвою "підхід Вютріха", покладалися повністю на гомоядерні протонні 1Н ЯМР експерименти, (Wuthrich, 2003). Цей підхід є ефективним для дозслідження білків вагою до ~ 12 кДа. З поширеням технікі ізотопного маркування рекомбінантних білків та гетероядерної спектроскопії на початку 1990-х розмір білків, придатних для структурних досліджень з високим дозволом, досяг близько 25 кДа і продовжує збілшуватись . Досягнення в гетероядерних спектроскопії були настільки успішними , що підхід Вютріха використовують все рідше, навіть для білків менше 12 кДа.

Динамічно розвивається зараз твердофазовий ЯМР, який є дуже многообіцяючою технікою для визначення структури біомолекул, особливо мембраною білків ( Andronesi та ін, 2005 ; . Mc-Дермотт , 2009) та фібрілярних білкових агрегатів (Tycko , 2006).

Теоретичні основи методу

Розщеплення енергетичніх уровнів протону у магнітному полі

Головним чинником, який зумовлює можливість ЯМР-спектроскопії є наявність у атомних ядер cпіну - квантовомеханічної характеристиці елементарної частки, такої ж фундаметнальної як маса або заряд. Спін ядер може приймати цілі або напівцілі значення. Згідно з законами квантової механіки, ядра атомів с цілими спінами не мають магнітного моменту і у зовнішньому магнітному полі енергетичні рівні ціх атомів є виродженими, тобто мають одинакову енергію. На відмину від них, ядрa з полуцілим спіном у магнітному полі демонструють зееманівське розщеплення. Для протону зі спіном 1/2 магнітий момент може приймати значення +1/2 та - 1/2, тоді для нього:

$\Delta {E_{Zeeman}}=E_{m_{l=-1/2}}-E_{m_{l=1/2}}={1 \over 2}\gamma \hbar B_{0}-\left(-{1 \over 2}\gamma \hbar B_{0}\right)=\gamma \hbar B_{0}\$

Iзотоп $\gamma$(107рад c-1 T-1) Розповсюженність ізотопу(%) 1H 26.752 212 8 99.99 13C 6.728 284 1.07 15N −2.712 618 04 0.37 31P 10.839 100 19F 25.181 100 (А) Спад свободної індукції. Косінус-компонента гіпотетичного сігналу. (Б)Частотний спектр. Фурьє-перетвореня поодинокого косінус сігналу дає єдиний пік на частоті прецесії ядра. Швидкість зпаду зумовлює ширину піку - повільний зпад відповідає гострому піку Наявність у системі декількох рівней енергії є основою будь-якого спектроскопічного методу. Але на відміну від напріклад, оптичної спектроскопії, реєстрація енергії поглинання або іспускання неможливо у разі ЯМР через наднизьки значення $\Delta {E}$. Замість цього, використовується підхід під назвою імпульсного перетворення Фур'є. Згідно з розподілом Максвелла-Больцмана у зовнішньму магнітному полі більшість ядер знаходяться на низшому енергетичному стані, що приводить до об'ємної намагніченості зразку у напрямку прикладеного магнітного поля. Для маніпулювання з цією намагніченостью використовуються радіочастотні імпульси певної довжини та інтенсівності, які дозводяють змінити напрямок намагніченості ядер. Частіше за все використовують 90° або 180° імпульси. Після прикладення 90° імпульсу cумарний вектор намагніченості ядер не буде оріентованим уздовж поля, а буде спрямований перпендікулярно до нього. Як тільки перпендікулярна намагніченость буде створена, сістема починає повертатися стан з меньшою енергією і вектор намагніченості повертається до начальної оріентаціі здовж ветора зовнішнього поля, обертаючись навколо нього з певною частотою. Це обертання має назву прецесії. Прецесія вектору намагніченості через електромагнітну індукцію, викликає появу токів у спеціальній катушці спектрометру, який реєструеється як залежний від часу сігнал і має назву спаду свободної індукції. Далі за допомогою математичної процедури, яка має назву швидкого перетворення Фурьє, сігнал перетворюється в функцію частоти, який і є питомим спектром. Частота такого сігналу має назву ларморової, залежіть від $\Delta {E_{Zeeman}}$ та згідно з законом Планка дорівнює : $\omega =\Delta {E_{Zeeman}}/\hbar =\gamma B_{0}\$, де $\gamma$ має назву гіроскопічного коєффіцієнту, і є сталою для кожного ізотопу. Хімічний ссув Одномірний 1H ЯМР спектр кальмодуліну (16.8 кДа) 95%/5% H2O/D2O розчин. Характерні діапазони для різних типів протонних ядер указані приблизно. Хімічний ссув приведений у стандартному вигляді - ppm, де 0ppm відповідає ларморової частоті протону Якби магнітні властивості ядер не відчували впливу електронів молекули, то спектр будь якої молекули уявляв би собою кілька окремих піків від ізотопів з полуцілим спіном, які входять до її складу. На справді орбітальні електрони молекул створють мікроскопічні магнітні поля, які посилюють чи послаблюють зовнішнє поле. Це приводить до різниці у значеннях поля для кожного атому у молекулі, і відповідно, до близьких, але різних значень ларморівської частоти для кожного атому у молекулі. Саме цей, так званий хімічний ссув дає спектральну інформацію про хімічну будову молекули. Різниця у частотах атомів з різним оточенням пропорційна силі зовнішньго поля, саме чому розврізняюча спроможність спектрометру росте з ростом сили магнітного поля. Через те, що значення хімічного ссуву відносно ларморової частоти дуже малі, а також для уніфікації усіх ЯМР експеріментів, ЯМР спектри відображать у мільоних долях від значення Ларморової частоти (parts per million) ppm. Спектрометри калібруються по резонансній частоті низькомолекулярних сполук (тетраметіл сілану або тяжкої води), що робить можливим порівняння спектрів отриманих на різних спектроментрах. Спін-спінова взаємодія (скалярна) Кількість піків Співвідношення інтенсивностей Cінглет 1 Дуплет 1:1 Тріплет 1:2:1 Квартет 1:3:3:1 Квінтет 1:4:6:4:1 Секстет 1:5:10:10:5:1 Септет 1:6:15:20:15:6:1 Cхематичний одномірний 1H ЯМР спектр етанолу. Згідно зі спектром, у молекулі є три типі H атомів. Гідроген (H) -OH груп не взаємодіє з іншими, тому творює сінглетний пік, в той час як атоми гідрогену у складі CH3- та CH2-груп взаємодіуть поміж собою, форумуючи триплет та кварет піків відповідно. Ще одним важливим для ЯМР спектроскопії квантовим ефектом є взаємодія спінів ЯМР-активних атомів через хімічний зв'язок між ними. На практиці це приводить до розщеплення піків атомів. Для атомів зі спіном 1/2 взаємодія з n аналогічними атомами приводить до n+1 мультіплету з інтенсивностью піків яка підпорядковується трикутнику Паскаля. Важливо, що зв'язки між ядрами, які хімічно еквівалентні (тобто, мають однаковий хімічний зсув) не має ніякого впливу на спектри ЯМР, а розщеплення піків за рахунок взаємодії атомів, які знаходяться дальше ніж за 3 хімічних зв'язки, практично не можливо зпостережувати. Виключенням є циклічні органічні сполуки, в яких патерн розщеплення є складнішим. Наприклад, у 1H ЯМР спектрі етанолу, пікі протонів зі складу CH3 групи поділяються на триплет із співвідношенням інтенсивностей 1:2:1 через взаємодію з протонами метіленової групи. Аналогічно, пікі протонів з CH2 групи розділяються на квартет із співвідношенням інтенсивностей 1:3:3:1 через взаємодію з протонами CH3. В принципі, два CH2 протона мали б також бути розділені ще і у дублет з утворенням подвійного квартету через взаємодію с протоном гідроксілу, але міжмолекулярний обмін кислих гідроксильних протонів часто унеможливлює спін-спінову взаємодію з цим атомом. Спін-спінова взаємодія з будь-яким іншим атомом з полуцілим спіном також приводить до розщеплення піків, але їх кількість і інтенсівність не підпорядковується правилу трикутнику Паскаля через більші квантові числа цих ядер і, відповідно, більшу кількість можливих квантових станів. Спін-спінова взаємодія дає безпосередню інформацію про сусідні ЯМР-активні ядра у молекулі, що може бути особливо важливим для ідентифікації ядер з однаковим хімічним ссувом у складних багатоядерних спектрах. Однак в деякіх випадках, розщеплення піків може бути непотрібним, тому спін-спінова взаємодія конкретного ізотопу может бути деактивована за допомогою спеціальних прийомів. Релаксація В ситуаціі равноваги, коли до ЯМР активних ядер прикладено зовнішнє магнітне поле $B_{0}$, сумарний вектор намагніченості $M_{0}$ направлений вздовж поля, а перпендікулярні складові вектора намагніченості $M_{0}=0$ (якщо ось z направлена вздовж напрямку поля). У разі прикладання 90° імпульсу, вектор намагніченості потрапляє в площину XY, і починає обертатися з ларморовою частотою. Після закінченя дії імпульсу вектор намагніченості почне повертатися до початкового згідно з: $M_{z}(t)=M_{0}\left(1-e^{-t/T_{1}}\right)$ Параметр $T_{1}$ має назву спін-решеточної релаксаціі. Існує інший тип релаксації у ЯМР, який зумовлений тим, що ядра прецесують не абсолютно сінхронно, а як група багатьох так званих спінових пакетів. Це приводить до того що з часом сумарний вектор намагніченості від усіх ядер експонінційно зменшується, навіть якщо утримувати його у XY площині. $M_{xy}(t)=M_{xy}(0)e^{-t/T_{2}}\,$, де параметр T2 - так звана спін-спінова релаксація. У більшості практично важливих випадків $T_{1}$ більше ніж $T_{2}$, тому значення $T_{1}$ використовується як практичний ліміт, впродовж якого реєстрація ЯМР сігналу має сенс. Для більшості білків значення спін-решеточної релаксації лежить у інтервалі десятків мс. Як вже було вказане вище, швидкість релаксації безпосередньо впливає на форму піків у ЯМР сігналі, а релаксаційні властивості макромолекул залежать від іх розміру, конформації, що робить можливим досліждення динаміки макромолекул за допомогою ЯМР. Ядерний ефект Оверхаузера Даний ефект полягає у зміні інтенсівності ЯМР сігналу при взаємодії двух ядер через діполь-діпольну взаємодію між ними. Важливо зауважити що ця взаємодія на відміну від, наприклад, скалярної спін-спінової взаємодії, відбувається скрізь простір без участі молекулярних електронів. Ядерна оверхаузівська взаємодія обернено пропорційна шостій ступені відстані, тому може бути зареєстрована тільки для атомів, які знаходяться к безпосередній близкості. Зміна інтенсівності піків у так званих NOESY експеріментах (від англqіського Nuclear Overhauser Effect) дає можливість вирахувати так званні дістанційні обмеження між ЯМР активними ядрами, які у свою чергу, тобто є основою для створення cтруктури молекули яка досліджується. Апаратна частина Приготування зразку Віднесення амінокислотних залишків Рєстрейнс Обчислювання та валідація структури Визначення структури білків за допомогою ЯМР-спектроскопії зазвичай складається з кількох послідовних стадій, в кожній з яких використовуються свої методи. Стисло, ці стадії включають підготовку зразка, отримання спектру, розпізнавання резонансів, обчислення зв'язків і в результаті обчислення та оцінки структури. Джерела |}|}|}