Профілювання полісом
Профілювання полісом - техніка в молекулярній біології, яка використовується для вивчення асоціації мРНК з рибосомами . Важливо зазначити, що ця методика відрізняється від профілювання рибосом . Обидві методики були розглянуті [1] і обидві використовуються в аналізі транслатома, але дані, які вони генерують, мають дуже різні рівні специфічності. При використанні експертами, методика просто відтворювана: 3 профілі на першому зображенні взято з 3 різних експериментів.[2]
Процедура[ред. | ред. код]
Процедура починається з виготовлення клітинного лізату клітин, що цікавлять. Цей лізат містить полісоми, моносоми (складаються з однієї рибосоми, розташованої на мРНК ), малу (40S в еукаріот ) і велику (60S в еукаріот) рибосомні субодиниці, «вільну» мРНК і безліч інших розчинних клітинних компонентів.
Процедура продовжується створенням безперервного градієнта сахарози безперервно змінної щільності в центрифужній пробірці. У використовуваних концентраціях (у прикладі 15-45%) сахароза не порушує асоціацію рибосом і мРНК. 15% градієнта знаходиться у верхній частині трубки, а 45% – унизу через різну щільність .
Певна кількість (як вимірюється оптичною густиною ) лізату потім акуратно наноситься поверх градієнта в трубці. Незважаючи на те, що лізат містить велику кількість розчинного матеріалу, щільність набагато менша, ніж 15% сахарози, тому його можна зберігати як окремий шар у верхній частині пробірки, якщо це робити обережно.
Для розділення компонентів лізату препарат центрифугують. Це прискорює компоненти лізату з силою тяжіння, яка у багато разів перевищує силу тяжіння, і таким чином просуває їх через градієнт залежно від того, наскільки «великими» є окремі компоненти. Малі (40S) субодиниці просуваються менше в градієнт, ніж великі (60S) субодиниці. Рибсоми 80S на мРНК подорожують далі (зверніть увагу, що внесок розміру мРНК у пройдену відстань незначний). Полісоми, що складаються з 2 рибосом, подорожують далі, полісоми з 3 рибосомами подорожують ще далі і далі. «Розмір» компонентів позначається S, одиницею Сведберга . Зверніть увагу, що один S = 10 −13 секунд, і що концепція «великого» насправді є надмірним спрощенням.
Після центрифугування вміст пробірки збирають у вигляді фракцій зверху (менші, повільніше) до низу (більші, швидше) і визначають оптичну щільність фракцій. Перші видалені фракції містять велику кількість відносно малих молекул, таких як тРНК, окремі білки тощо.
Додатки[ред. | ред. код]
Цю техніку можна використовувати для вивчення загального ступеня трансляції в клітинах (наприклад,[3][4][5] ), але її можна використовувати набагато більш конкретно для вивчення окремих білків та їх мРНК. Як приклад, показаний у нижній частині малюнка, білок, який становить частину малої субодиниці, спочатку може бути виявлений у фракції 40S, потім майже зникає з фракції 60S (поділ на цих градієнтах не є абсолютним), а потім знову з’являється у 80-х роках і полісомні фракції. Це вказує на те, що в клітині міститься дуже мало білка, який не є частиною малої субодиниці. Навпаки, у верхньому рядку фігури імуноблоту розчинний білок з’являється у розчинних фракціях і пов’язаний з рибосомами та полісомами. Конкретний білок є білком-шапероном, який (коротше кажучи) допомагає згортати новонароджений пептид, коли він екструдується з рибосоми. Як і інша робота
Досліджено існування прямого зв’язку шаперона з рибосомою.[2]
Техніка також використовується для вивчення ступеня трансляції конкретної мРНК [6] . У цих експериментах 5'- і 3'-послідовності мРНК досліджувалися на предмет їх впливу на кількість утвореної мРНК і на наскільки добре транслювалися мРНК. Як показано, не всі ізоформи мРНК транслюються з однаковою ефективністю , навіть якщо їх кодуючі послідовності однакові.[6]
Список літератури[ред. | ред. код]
- ↑ Piccirillo, CA та ін. (2014). Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6): 503—511. doi:10.1038/ni.2891. PMID 24840981.
- ↑ а б Hanebuth, MA та ін. (2016). Multivalent contacts of the Hsp70 Ssb contribute to its architecture on ribosomes and nascent chain interaction. Nature Communications. 7: 13695. Bibcode:2016NatCo...713695H. doi:10.1038/ncomms13695. PMC 5150220. PMID 27917864.
- ↑ Lin, CJ та ін. (2010). The antidepressant sertraline inhibits translation initiation by curtailing mammalian target of rapamycin signaling. Cancer Research. 70 (8): 3199—3208. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-4072. PMID 20354178.
- ↑ Coudert, L та ін. (2014). Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments (87). doi:10.3791/51164. PMC 4193336. PMID 24893838.
- ↑ Molon, M та ін. (2016). The rate of metabolism as a factor determining longevity of the Saccharomyces cerevisiae yeast. Age (Dordrecht, Netherlands). 38 (1): 11. doi:10.1007/s11357-015-9868-8. PMC 5005888. PMID 26783001.
- ↑ а б Floor, SN; Doudna, JA (2016). Tunable protein synthesis by transcript isoforms in human cells. eLife. 5. doi:10.7554/eLife.10921. PMC 4764583. PMID 26735365.
{{cite journal}}: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання)