Рекомбінантна ДНК

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до навігації Перейти до пошуку

Рекомбінантна ДНК (рДНК) - штучно створені молекули ДНК за допомогою методів генетичної рекомбінації, які поєднують генетичний матеріал різного походження - фрагмент ДНК, який потрібно клонувати, та кільцеву молекулу ДНК. На відміну від природньої рекомбінації генетичного матеріалу, рДНК створюється за допомогою низки лабораторних методів.

Клонування послідовностей полягає у збільшенні їхньої кількості за посередництва бактерій (клітина-господар) чи інших клітин, у яких вектор може ампліфікуватися. У клітині-господарі утворюються ідентичні копії вектора зі вставленим у нього геном. Під час поділу клітин рекомбінантні молекули ДНК передаються до нащадків цієї клітини. З часом утворюються колонії бактерій, які містять ідентичних клонів вихідної клітини, кожен з яких має одну або більшу кількість копій рДНК. Тобто ген у складі молекули рДНК є клонованим[1]. В результаті експресії рДНК, синтезуються рекомбінантні білки, проте утворення білка необов'язкове.

Поєднання молекул ДНК з різних організмів можливе через їх однакову хімічну природу, хоча такі молекули різняться за нуклеотидними послідовностями, через що рДНК також називають химерною, подібно до міфічної істоти [2].

Перші молекули рДНК були створені у 1973 році Полом Бергом, Гербертом Боєром, Енні Чанг і Стенлі Коеном зі Стенфордського університету та Каліфорнійського університету в Сан-Франциско. У1975 році на "The Asilomar Conference” обговорювалося регулювання та безпечне використання технології рДНК, доцільність використання цієї технології. Однак з середини 80-х років минулого століття поступово зростає кількість продуктів, створених за допомогою рДНК [3].

Інструменти та етапи створення рекомбінантної ДНК[ред. | ред. код]

Для утворення рДНК потрібні ферменти - ендонуклеази рестрикції, лігази.

Ендонуклеази - це ферменти, які розщеплюють молекулу ДНК у специфічних послідовностях або поблизу них, котрі складаються з чотирьох-восьми пар основ. Ендонуклеази у організмах бактерій є природним явищем (для захисту від проникнення чужинної ДНК, наприклад вірусу), яке використовують у лабораторній техніці [4]. Багато нуклеаз непридатні для використання у біотехнології, оскільки розщеплюють молекули ДНК випадковим чином, як результат – утворюється набір фрагментів різного розміру. Тому послуговуються ферментами, які зв’язуються з відомими сайтами на ДНК, бажано щоб вони були унікальними, що сприятиме утворенню меншої кількості фрагментів [5].

Багато рестрикційних ендонуклеаз роблять простий дволанцюговий розріз в середині послідовності розпізнавання, що призводить до утворення тупого кінця або липкого (когезивного), який містить короткі одноланцюгові виступи на кожному кінці молекули. У останньому випадку за рахунок комплементарності, кінці розрізаної молекули ДНК можуть об'єднуватись між собою. Ендонуклеази рестрикції з різними послідовностями розпізнавання можуть утворювати однакові липкі кінці. Наприклад, BamHI (послідовність розпізнавання GGATCC) і BglII (AGATCT) створюють липкі кінці GATC [1].

Результат дії рестриктаз на молекули ДНК можна перевірити, провівши електрофорез у агарозному гелі. Для визначення розміру фрагментів використовують маркер мас.

Лігазами для генетичної інженерії послуговуються, щоб відновити розриви, які виникли в одному з ланцюгів дволанцюгової молекули та з'єднати разом окремі молекули ДНК або кінці однієї молекули шляхом створення двох фосфодиефірних зв'язків (по одному на кожен ланцюг) [1].

Етапи створення рДНК[ред. | ред. код]

1. Відбір цільової послідовності, плазміди, ферментів.

2. Розщеплення відібраної молекули ДНК та плазміди ендонуклеазами рестрикції.

3. Лігування фрагменту ДНК та плазміди ДНК-лігазами, як наслідок утворюється векторна молекула. Крім послідовності інтересу вектор має містити гени, які б забезпечували відбір клітин, які містять вектор зі вставленою цільовою послідовністю.

4. Введення вектора у бактеріальну клітину, в якій відбуватиметься ампліфікація послідовності у складі вектора сумісно з поділами клітин.

5. Відбір мікроорганізмів з рекомбінантними вектором з геном інтересу [6].

Експресія ДНК[ред. | ред. код]

У бактеріях чи інших організмах, в яких відбувалася ампліфікація вектора з послідовністю інтересу, експерсія рДНК може відбуватися або ні. У випадку експресії можна отримувати транскрипти з цієї послідовності та рекомбінантні білки. До складу плазмід експерсії входять реплікони, промотори, селективні маркери, множинні сайти клонування, послідовності видалення злитого (рекомбінантного білка). Реплікон складається з одного сайту початку реплікації та пов’язаних з ним cis-діючих елементів. Слід підбирати копійність плазміди, оскільки збільшення кількості плазмід сприятиме зростанню концентрації білка в клітині, що може викликати метаболічне навантаження, яке зменшуватиме швидкість росту бактерій, збільшуватиме нестабільність плазмід. Найбільш поширеними промоторами є lac промотор, промотор фагу Т7. Промотори підбирають залежно від сили та його регулювання. Селективними маркерами є переважно гени антибіотиків (ампіциліну, канаміцину, тетрацикліну та ін.), які використовують для відбору трансформованих клітин. Крім того, додають послідовності, які забезпечували б:

1) виявлення гена за його експресією з подальшим очищенням;

2) досягненням розчинності;

3) очищення від компонентів клітини-господаря та культурального середовища.

Ці три пункти можна забезпечити шляхом наявності амінокислотної послідовності (пептидної мітки) або великого поліпептиду (партнера злиття) у тандемі з білком-інтересу, у такому випадку утворюється химерний білок [7]. Можуть додаватися послідовності, які спрямовуватимуть білок у певне місце (клітинний компартмент або позаклітинне середовище), сприятимуть (для уникнення деградації ферментними системами клітини-господаря) [8].

Відбір організмів, які містять рекомбінантну ДНК[ред. | ред. код]

Переважно організми, які містять рДНК мають нормальний фенотип, тобто їх морфологія, метаболізм не змінилися, порівняно з організмами без такої ДНК. Щоб визначити наявність рекомбінантних послідовностей зазвичай використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Якщо ген інтересу експресується у складі вектору, то можна виявити РНК та/або білки за допомогою реакції зворотньої транскрипції (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) або шляхом вестерн-гібридизації [1]. У деяких випадках можуть спостерігатися значні зміни фенотипу, що не є нормою. Однак якщо обраний ген, продукт якого здатний генерувати біологічну активність в організмі господаря, то це можлива ситуація[9]. Прикладами є токсичність рекомбінантного білка для організму господаря, особливо якщо він надмірно експресується або експресується в невідповідних клітинах або тканинах у випадку багатоклітинних організмів-господарів.

У деяких випадках рекомбінантна ДНК може мати шкідливий вплив, навіть якщо вона не експресується. Одним із механізмів, за допомогою якого це відбувається, є інсерційна інактивація, за якої рДНК вставляється в ген клітини-господаря. У деяких випадках дослідники використовують це явище, щоб "нокаутувати" гени ("knock out") та визначити їхню біологічну функцію. Інший механізм, за допомогою якого вставка рДНК у хромосому може впливати на експресію генів – активація раніше мовчазних генів клітини-господаря. Це може статися, наприклад, коли фрагмент рДНК з активним промотором розташовується поруч із раніше неактивним геном клітини-господаря, або коли хазяйський ген, функціональність якого пригнічує експресію іншого гена, піддається інсерційній інактивації рекомбінантною ДНК[10].

Застосування технології рекомбінантної ДНК[ред. | ред. код]

рДНК широко використовується у дослідженнях, біотехнології та медицині, ветеринарії, сільському господарстві, біоінженерії, для отримання комерційних продуктів для людини та тварин, отримання самих тварин. Наприклад, GloFish є зарестрованим торговим брендом, який продає генетично модифікованих акваріумних рибок, які здатні до флуоресценції [1]. Рекомбінантна ДНК використовується для ідентифікації, картування та секвенування генів, а також для визначення їхньої функції. рДНК використовують як зонди для вивчення експресії генів в окремих клітинах, тканинах цілих організмів. Рекомбінантні білки широко використовуються у експериментах, для створення антитіл, які слугуватимуть зондами у дослідженнях синтезу білка в клітинах і організмах [11].

Рекомбінантний білок Характеристика
Хімозин - фермент, який синтезується у сичузі ВРХ. Традиційно отримують із шлункового соку телят, яких годували молоком;

- потрібен для виробництва сирів;

- перший генетично модифікований білок, який використовують у комерційних цілях;

- у біотехнологічному виробництві для продукування хімозину використовують непатогенний штам К-21 E. coli. Синтезований рекомбінантний білок структурно подібний природному ферменту. Такий спосіб дозволяє здешевити виробництво та отримувати у значно більших кількостях білок;

- близько 60% твердого сиру в США виготовляють з використанням генно-інженерного хімозину;

- у 1990 році FDA присвоїло хімозину статус «визнаного загалом безпечним» (GRAS) на основі даних, які показують, що фермент безпечний [12].

Інсулін людини - традиційно отримують з підшлункової залози свині та ВРХ;

- використовують для лікування інсулінозалежного діабету;

- рекомбінантний - синтезують шляхом введення гена людського інсуліну в E. coli або дріжджі (Saccharomyces cerevisiae) [13].

Гормон росту людини (соматотропін) - призначається пацієнтам, у яких гіпофіз виробляє недостатню кількість соматотропіну для підтримки нормального росту та розвитку;

- до створення технології рекомбінантного білка, гормон отримували з гіпофізів трупів, що провокувало у пацієнтів розвиток хвороби Кройтцфельда-Якоба;

- препарат використовують у терапевтичних цілях, однак, можливе зловживання [14][15].

Фактор згортання крові VIII - призначають пацієнтам з гемофілією, які не здатні виробляти фактор VIII у достатніх кількостях для підтримки нормального згортання крові [16];

- традиційна техніка вироблення – використання людської крові від донорів. Недолік такого підходу – ризик передачі інфекційних захворювань, які передаються через кров (ВІЛ, гепатит В). DrugBank entry.

Вакцина проти гепатиту В - містить поверхневий антиген вірусу гепатиту В, який виробляється в дріжджових клітинах;

- розробка рекомбінантної субодиничної вакцини є важливою, оскільки вірус не можна культивувати in vitro. [1].

Діагностика ВІЛ-інфекції 1. Тест на антитіла (ELISA або вестерн-блот) – використовується рекомбінантний білок ВІЛ для визначення наявності антитіл, які організм виробляє у відповідь на ВІЛ-інфекцію.

2. ДНК-тест – послуговуються полімеразною ланцюговою реакцією зі зворотньою транскрипцією. Розробка такого тесту стала можливою завдяки аналізу послідовностей геномів ВІЛ та молекулярне клонування.

Сторінка тестування на ВІЛ від Центру контролю захворювань США (CDC) [2].

Золотий рис - сорт рису, створений для експресії ферментів, відповідальних за біосинтез β-каротину;

- перспективний через можливе зменшення випадків дефіциту вітаміну А у світі;

- наразі не використовується через вирішення питань регулювання інтелектуальної власності [17].

Стійкі до гербіцидів культури - розроблено комерційні сорти важливих сільськогосподарських культур (сої, кукурудзи, сорго, ріпаку, люцерни та бавовнику) з рекомбінантним геном, який забезпечує стійкість до гербіциду гліфосату (торгова назва Раундап), які використовуються у комерційних цілях;

- спрощення боротьби з бур’янами за допомогою гліфосату [18].

Культури, стійкі до комах - для боротьби з комахами використовують Bacillus thuringeiensis, які виробляють (Bt-токсин) з інсектицидними властивостями [18];

- така технологія широко використовується у сільському господарстві та садівництві;

- проблеми з впливом (чи його відсутністю) на навколишнє середовище остаточно не вирішені [19].

  1. ↑ а б в г д Brown, T. A. (2006). Gene cloning and DNA analysis : an introduction (вид. 5th ed). Oxford: Blackwell Pub. ISBN 1-4051-1121-6. OCLC 58451766. 
  2. ↑ Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo A. (17 квітня 2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5. ISSN 1664-302X. PMC PMC4029002. PMID 24860555. doi:10.3389/fmicb.2014.00172. Процитовано 2 листопада 2022. 
  3. ↑ Khan, Suliman; Ullah, Muhammad Wajid; Siddique, Rabeea; Nabi, Ghulam; Manan, Sehrish; Yousaf, Muhammad; Hou, Hongwei (8 грудня 2016). Role of Recombinant DNA Technology to Improve Life. International Journal of Genomics (англ.) 2016. с. e2405954. ISSN 2314-436X. doi:10.1155/2016/2405954. Процитовано 2 листопада 2022. 
  4. ↑ Cooper, Geoffrey M. (2000). Recombinant DNA. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition (англ.). Процитовано 2 листопада 2022. 
  5. ↑ Stryjewska, Agnieszka; Kiepura, Katarzyna; Librowski, Tadeusz; Lochyński, Stanisław (2013-09). Biotechnology and genetic engineering in the new drug development. Part I. DNA technology and recombinant proteins. Pharmacological Reports (англ.) 65 (5). с. 1075–1085. doi:10.1016/S1734-1140(13)71466-X. Процитовано 2 листопада 2022. 
  6. ↑ Rosenberg, Leon E.; Rosenberg, Diane Drobnis (2012). Structure of Genes, Chromosomes, and Genomes. Human Genes and Genomes (англ.). Elsevier. с. 75–96. ISBN 978-0-12-385212-0. doi:10.1016/b978-0-12-385212-0.00006-8. 
  7. ↑ L., Rosano, Germán; A., Ceccarelli, Eduardo (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology (English) 0. ISSN 1664-302X. doi:10.3389/fmicb.2014.00172/full. Процитовано 2 листопада 2022. 
  8. ↑ Burgess, Richard R.; Deutscher, Murray P. (2009). Guide to protein purification (вид. 2nd ed). San Diego, Calif: Academic Press/Elsevier. ISBN 978-0-12-374536-1. OCLC 463300660. 
  9. ↑ Ye, Xudong; Al-Babili, Salim; Klöti, Andreas; Zhang, Jing; Lucca, Paola; Beyer, Peter; Potrykus, Ingo (14 січня 2000). Engineering the Provitamin A (β-Carotene) Biosynthetic Pathway into (Carotenoid-Free) Rice Endosperm. Science (англ.) 287 (5451). с. 303–305. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.287.5451.303. Процитовано 2 листопада 2022. 
  10. ↑ Koller, B H; Smithies, O (1992-04). Altering Genes in Animals by Gene Targeting. Annual Review of Immunology (англ.) 10 (1). с. 705–730. ISSN 0732-0582. doi:10.1146/annurev.iy.10.040192.003421. Процитовано 2 листопада 2022. 
  11. ↑ Alberts, Bruce; Wilson, John; Hunt, Tim (2008). Molecular biology of the cell (вид. 5th ed). New York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4105-5. OCLC 82473851. 
  12. ↑ Foreign Press Centers. United States Department of State (амер.). Процитовано 2 листопада 2022. 
  13. ↑ Insulin aspart. Wikipedia (англ.). 24 жовтня 2022. Процитовано 2 листопада 2022. 
  14. ↑ Von Fange, Tim; McDiarmid, Todd; Mackler, Leslie; Zolotor, Adam (2008-09). Clinical inquiries: can recombinant growth hormone effectively treat idiopathic short stature?. The Journal of Family Practice 57 (9). с. 611–612. ISSN 1533-7294. PMID 18786336. Процитовано 2 листопада 2022. 
  15. ↑ Fernandez, Marifel Mitzi F.; Hosey, Robert G. (2009-01). Performance-enhancing drugs snare nonathletes, too. The Journal of Family Practice 58 (1). с. 16–23. ISSN 1533-7294. PMID 19141266. Процитовано 2 листопада 2022. 
  16. ↑ Manco-Johnson, Marilyn J. (1 січня 2010). Advances in the Care and Treatment of Children with Hemophilia. Advances in Pediatrics (English) 57 (1). с. 287–294. ISSN 0065-3101. PMID 21056743. doi:10.1016/j.yapd.2010.08.007. Процитовано 2 листопада 2022. 
  17. ↑ Foreign group roots for 'golden rice' in India. Deccan Herald (англ.). 18 березня 2015. Процитовано 2 листопада 2022. 
  18. ↑ а б Funke, Todd; Han, Huijong; Healy-Fried, Martha L.; Fischer, Markus; Schönbrunn, Ernst (29 серпня 2006). Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences (англ.) 103 (35). с. 13010–13015. ISSN 0027-8424. PMC PMC1559744. PMID 16916934. doi:10.1073/pnas.0603638103. Процитовано 2 листопада 2022. 
  19. ↑ Mendelsohn, Mike; Kough, J.; Vaituzis, Zigfridais; Matthews, K. (2003). Are Bt crops safe?. undefined (англ.). Процитовано 2 листопада 2022. 
Отримано з https://uk.wikipedia.org/w/index.php?title=Рекомбінантна_ДНК&oldid=37785206