ЯМР-спектроскопія білків

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до: навігація, пошук

ЯМР-спектроскопі́я білкі́в — метод структурної біології, в якому ЯМР-спектроскопія використовується для отримання інформації про структуру і динаміку білків[1]

Значення[ред.ред. код]

Метод ЯМР спектроскопії був розвинутий для застосування з біолічними макромолекулами, серед інших, швейцарськими дослідниками Ріхардом Ернстом та Куртом Вуртріхом , які були відзначенні Нобелівською премію з хімії 1991 та 2002 року відповідно. ЯМР є універсальним і важливим інструментом у сучасній біомолекулярній науці , здатний давати інформацію про структуру, динаміку і взаємодії білків та нуклеінових кислот та їх лігандів . ЯМР-спектроскопія та рентгенівська кристалографія зараз є єдиними методами , які можуть визначати структуру білків з атомним дозволом. На відміну від рентгенівської кристалографії , ЯМР високого дозволу має можливість вивчати біомолекули в більш природньому розчинному середовищі і не вимагає кристалізації. В даний час отриманні структури білків вагою до ~ 25 кДа є рутинною процедурою. Основним лімітуючим фактором спектроскопії ЯМР є принціпіально властива їй низька чутливість та ускладнення спектру з ростом молекулярної маси біомолекули . Як наслідок , розмір білків , які можуть бути вивчені з атомним дозволом, є обмеженим. З розвитком спектрометрів з сильнішими магнітами , кращих зондів і нових спектроскопічних методів, стало можливим дослідження білків з масою до 80 кДа[2] (Тугарінов та ін., 2005). ЯМР може також бути корисним і для більших білкових комплексів, особливо при поєднані структурних даних низького дозволу з іншими методами , такими як рентгенівське розсіювання під малими кутами en:SAXS ( Sunnerhagen та ін, 1996; Гришаєв та ін, 2005 , 2008 ; Wang та ін , 2009). ЯМР також дозволяє досліджувати нестаціонарні процеси, такі як кінетика ферментів (Henzler-Уайлдман та ін, 2007.) та внутрішньомолекулярну динаміку (Ішима і Torchia, 2000; Palmer, 2004). Визначення структури білків за допомогою ЯМР високого дозволу почалося з появою двовимірної спектроскопії на початку 1980-х. Перші двомірні техніки, які в данний час об'єднуть під назвою "підхід Вютріха", покладалися повністю на гомоядерні протонні 1Н ЯМР експерименти, (Wuthrich, 2003). Цей підхід є ефективним для дозслідження білків вагою до ~ 12 кДа. З поширеням техніки ізотопного маркування рекомбінантних білків та гетероядерної спектроскопії на початку 1990-х розмір білків, придатних для структурних досліджень з високим дозволом, досяг близько 25 кДа і продовжує збільшуватись . Досягнення в гетероядерній спектроскопії були настільки успішними , що підхід Вютріха використовують все рідше, навіть для білків менше 12 кДа.

Динамічно розвивається зараз твердофазовий ЯМР, який є дуже многообіцяючою технікою для визначення структури біомолекул, особливо мембраною білків ( Andronesi та ін, 2005 ; . Mc-Дермотт , 2009) та фібрілярних білкових агрегатів (Tycko , 2006).

Теоретичні основи методу[ред.ред. код]

Докладніше: ЯМР-спектроскопія
Розщеплення енергетичних рівнів протону у магнітному полі

Головним чинником, який зумовлює можливість ЯМР-спектроскопії є наявність у атомних ядер спіну - квантовомеханічної характеристики елементарної частки, такої ж фундаметнальної, як маса або заряд. Спін ядер може приймати цілі або напівцілі значення. Згідно з законами квантової механіки, ядра атомів с цілими спінами не мають магнітного моменту і у зовнішньому магнітному полі енергетичні рівні цих атомів є виродженими, тобто мають однакову енергію. На відміну від них, ядра з полуцілим спіном у магнітному полі демонструють зееманівське розщеплення. Для протону зі спіном 1/2 магнітий момент може приймати значення +1/2 та - 1/2, тоді для нього:

\Delta{E_{Zeeman}} = E_{m_{l=-1/2}}-E_{m_{l=1/2}}={1\over 2}\gamma \hbar B_0  -\left(-{1\over 2}\gamma \hbar B_0 \right )=\gamma \hbar B_0 \
Ізотоп \gamma(107рад c-1 T-1) Розповсюженність ізотопу(%)
1H 26.752 212 8 99.99
13C 6.728 284 1.07
15N −2.712 618 04 0.37
31P 10.839 100
19F 25.181 100
(А) Спад свободної індукції. Косінус-компонента гіпотетичного сигналу. (Б)Частотний спектр. Фурьє-перетвореня поодинокого косінус сигналу дає єдиний пік на частоті процесії ядра. Швидкість спаду зумовлює ширину піку - повільний спад відповідає гострому піку

Наявність у системі декількох рівнів енергії є основою будь-якого спектроскопічного методу. Але на відміну від наприклад, оптичної спектроскопії, реєстрація енергії поглинання або іспускання неможлива у разі ЯМР через наднизьки значення \Delta{E}. Замість цього, використовується підхід під назвою імпульсного перетворення Фур'є. Згідно з розподілом Максвелла-Больцмана у зовнішньому магнітному полі більшість ядер знаходяться на низшому енергетичному стані, що приводить до об'ємної намагніченості зразку у напрямку прикладеного магнітного поля. Для маніпулювання з цією намагніченістю використовуються радіочастотні імпульси певної довжини та інтенсивності, які дозволяють змінити напрямок намагніченості ядер. Частіше за все використовують 90° або 180° імпульси. Після прикладення 90° імпульсу сумарний вектор намагніченості ядер не буде орієнтованим уздовж поля, а буде спрямований перпендикулярно до нього. Як тільки перпендикулярна намагніченість буде створена, система починає повертатися в стан з меньшою енергією і вектор намагніченості повертається до начальної оріентаціі здовж ветора зовнішнього поля, обертаючись навколо нього з певною частотою. Це обертання має назву прецесії. Прецесія вектору намагніченості через електромагнітну індукцію, викликає появу токів у спеціальній котушці спектрометру, який реєструється, як залежний від часу сигнал і має назву спаду вільної індукції. Далі за допомогою математичної процедури, яка має назву швидкого перетворення Фурьє, сигнал перетворюється в функцію частоти, який і є питомим спектром. Частота такого сигналу має назву ларморової, залежіть від \Delta{E_{Zeeman}} та згідно з законом Планка дорівнює :

\omega=\Delta{E_{Zeeman}}/\hbar=\gamma B_0 \ , де \gamma має назву гіроскопічного коєффіцієнту, і є сталою для кожного ізотопу.

Хімічний зсув[ред.ред. код]

Одномірний 1H ЯМР спектр кальмодуліну (16.8 кДа) 95%/5% H2O/D2O розчин. Характерні діапазони для різних типів протонних ядер указані приблизно. Хімічний зсув приведений у стандартному вигляді - ppm, де 0ppm відповідає ларморової частоті протону

Якби магнітні властивості ядер не відчували впливу електронів молекули, то спектр будь-якої молекули уявляв би собою кілька окремих піків від ізотопів з полуцілим спіном, які входять до її складу. Насправді орбітальні електрони молекул створюють мікроскопічні магнітні поля, які посилюють чи послаблюють зовнішнє поле. Це призводить до різниці у значеннях поля для кожного атома у молекулі, і відповідно, до близьких, але різних значень ларморівської частоти для кожного атома у молекулі. Саме цей, так званий хімічний зсув дає спектральну інформацію про хімічну будову молекули. Різниця у частотах атомів з різним оточенням пропорційна силі зовнішньго поля, саме чому розрізнююча спроможність спектрометру росте з ростом сили магнітного поля. Через те, що значення хімічного зсуву відносно ларморової частоти дуже малі, а також для уніфікації усіх ЯМР експериментів, ЯМР спектри відображають у мільоних долях від значення Ларморової частоти (parts per million) ppm. Спектрометри калібруються по резонансній частоті низькомолекулярних сполук (тетраметіл сілану або тяжкої води), що робить можливим порівняння спектрів отриманих на різних спектрометрах.

Спін-спінова взаємодія (скалярна)[ред.ред. код]

Кількість піків Співвідношення інтенсивностей
Сінглет 1
Дуплет 1:1
Тріплет 1:2:1
Квартет 1:3:3:1
Квінтет 1:4:6:4:1
Секстет 1:5:10:10:5:1
Септет 1:6:15:20:15:6:1
Схематичний одномірний 1H ЯМР спектр етанолу. Згідно зі спектром, у молекулі є три типи H атомів. Гідроген (H) -OH груп не взаємодіє з іншими, тому утворює сінглетний пік, в той час як атоми гідрогену у складі CH3- та CH2-груп взаємодіють поміж собою, форумуючи триплет та кварет піків відповідно.

Ще одним важливим для ЯМР спектроскопії квантовим ефектом є взаємодія спінів ЯМР-активних атомів через хімічний зв'язок між ними. На практиці це приводить до розщеплення піків атомів. Для атомів зі спіном 1/2 взаємодія з n аналогічними атомами приводить до n+1 мультіплету з інтенсивністю піків яка підпорядковується трикутнику Паскаля. Важливо, що зв'язки між ядрами, які хімічно еквівалентні (тобто, мають однаковий хімічний зсув) не мають ніякого впливу на спектри ЯМР, а розщеплення піків за рахунок взаємодії атомів, які знаходяться далі ніж за 3 хімічних зв'язки, практично не можливо спостерігати. Виключенням є циклічні органічні сполуки, в яких патерн розщеплення є складнішим.

Наприклад, у 1H ЯМР спектрі етанолу, піки протонів зі складу CH3 групи поділяються на триплет із співвідношенням інтенсивностей 1:2:1 через взаємодію з протонами метіленової групи. Аналогічно, піки протонів з CH2 групи розділяються на квартет із співвідношенням інтенсивностей 1:3:3:1 через взаємодію з протонами CH3. В принципі, два CH2 протона мали б також бути розділені, ще і у дублет з утворенням подвійного квартету через взаємодію с протоном гідроксілу, але міжмолекулярний обмін кислих гідроксильних протонів часто унеможливлює спін-спінову взаємодію з цим атомом. Спін-спінова взаємодія з будь-яким іншим атомом з полуцілим спіном також приводить до розщеплення піків, але їх кількість і інтенсівність не підпорядковується правилу трикутнику Паскаля через більші квантові числа цих ядер і, відповідно, більшу кількість можливих квантових станів. Спін-спінова взаємодія дає безпосередню інформацію про сусідні ЯМР-активні ядра у молекулі, що може бути особливо важливим для ідентифікації ядер з однаковим хімічним зсувом у складних багатоядерних спектрах. Однак в деякіх випадках, розщеплення піків може бути непотрібним, тому спін-спінова взаємодія конкретного ізотопу может бути деактивована за допомогою спеціальних прийомів.

Релаксація[ред.ред. код]

Докладніше: Релаксація

В ситуаціі рівноваги, коли до ЯМР активних ядер прикладено зовнішнє магнітне поле B_0, сумарний вектор намагніченості M_0 направлений вздовж поля, а перпендикулярні складові вектора намагніченості M_0=0 (якщо ось z направлена вздовж напрямку поля). У разі прикладання 90° імпульсу, вектор намагніченості потрапляє в площину XY, і починає обертатися з ларморовою частотою. Після закінчення дії імпульсу вектор намагніченості почне повертатися до початкового згідно з:

M_z(t) = M_0\left( 1 - e^{-t/T_1} \right)

Параметр T_1 має назву спін-граткової релаксаціі. Існує інший тип релаксації у ЯМР, який зумовлений тим, що ядра прецесують не абсолютно сінхронно, а як група багатьох так званих спінових пакетів. Це приводить до того що з часом сумарний вектор намагніченості від усіх ядер експонінційно зменшується, навіть якщо утримувати його у XY площині.

M_{xy}(t) = M_{xy}(0) e^{-t/T_2} \,, де параметр T2 - так звана спін-спінова релаксація.

У більшості практично важливих випадків T_1 більше ніж T_2, тому значення T_1 використовується як практичний ліміт, впродовж якого реєстрація ЯМР сигналу має сенс. Для більшості білків значення спін-граткової релаксації лежить у інтервалі десятків мс. Як вже було вказане вище, швидкість релаксації безпосередньо впливає на форму піків у ЯМР сігналі, а релаксаційні властивості макромолекул залежать від іх розміру, конформації, що робить можливим досліждення динаміки макромолекул за допомогою ЯМР.

Ядерний ефект Оверхаузера[ред.ред. код]

Даний ефект полягає у зміні інтенсівності ЯМР сигналу при взаємодії двух ядер через діполь-діпольну взаємодію між ними. Важливо зауважити, що ця взаємодія на відміну від, наприклад, скалярної спін-спінової взаємодії, відбувається скрізь простір без участі молекулярних електронів. Ядерна оверхаузівська взаємодія обернено пропорційна шостій ступені відстані, тому може бути зареєстрована тільки для атомів, які знаходяться в безпосередній близкості. Зміна інтенсивності піків у так званих NOESY експериментах (з англійської Nuclear Overhauser Effect) дає можливість вирахувати так званні дистанційні обмеження між ЯМР активними ядрами, які у свою чергу, тобто є основою для створення структури молекули, яка досліджується.

Апаратна частина[ред.ред. код]

Приготування зразку[ред.ред. код]

Віднесення амінокислотних залишків[ред.ред. код]

Рєстрейнс[ред.ред. код]

Обчислювання та валідація структури[ред.ред. код]


Визначення структури білків за допомогою ЯМР-спектроскопії зазвичай складається з кількох послідовних стадій, в кожній з яких використовуються свої методи. Стисло, ці стадії включають підготовку зразка, отримання спектру, розпізнавання резонансів, обчислення зв'язків і в результаті обчислення та оцінки структури.

Див. також[ред.ред. код]

Джерела[ред.ред. код]

  1. McDermott, A. 2009. Structure and dynamics of membrane proteins by magic angle spinning solid-state NMR. Ann. Rev. Biophys. 38:385-403.
  2. Tugarinov, V. Choy, W., Orekhov, V., Kay, L.E Solution NMR-derived global fold of a monomeric 82-kDa enzyme // Proc Natl Acad Sci U S A. — 102(3) (2005) С. 622-7.


Молекула міоглобіну Це незавершена стаття про білки.
Ви можете допомогти проекту, виправивши або дописавши її.