Скляний мікроелектрод

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
Перейти до навігації Перейти до пошуку
Заповнений електролітом скляний микроэлектрод в утримувачі. Видно введений у стовбур електроду хлорований срібний дріт.
У цього терміну існують і інші значення, див. Електрод (значення)

Скляни́й мікроелектро́д — дуже тонка скляна піпетка, заповнена електролітом. Використовується в електрофізіології. Розроблення мікроелектродних методів дозволило вести електрофізіологічні дослідження на рівні окремих клітин.

Діаметр кінчику скляного мікроелектрода близько 0,5 мкм, іноді — менше 0,1 мкм[1], при розгляданні в оптичний мікроскоп він може бути невиразний.

Не слід плутати цей інструмент зі субтильними моделями іонометричних скляних електродів, що, зокрема, також використовуються в електрофізіології.

Застосування[ред. | ред. код]

Існують три основні способи використання мікроелектродів:

  • для внутрішньоклітинної реєстрації електричних параметрів клітинних мембран,
  • для поляризації клітинних мембран електричним струмом,
  • для введення різних речовин усередину клітини (іонофорез) або подання їх на її поверхню (аплікація).

Подальшим розвитком мікроелектродної техніки став метод локальної фіксації потенціалу (метод patch-clamp)[2]. Розроблені для цього методу спеціальні типи мікроелектродів зазвичай називають мікропіпетками. Чутливість методу дозволяє реєструвати активність окремих іонних каналів клітинної мембрани.

Історія[ред. | ред. код]

До розроблення скляних мікроелектродів у фізіології використовувалися металеві електроди, наприклад, з вольфрамового дроту, заточеного електрохімічно[3]. Малий електричний опір металевих електродів дозволяв використовувати з ними примітивну реєструвальну апаратуру з малим вхідним опором. У деяких галузях такі електроди застосовуються і донині.

Уперше скляні мікроелектроди застосували 1949 року[4] Р. Лінґ і Р. В. Джерард[en] у своїй роботі з реєстрації мембранного потенціалу міоцитів жаби.

В. Л. Настук і А. Л. Годжкін 1950 року, використовуючи[5] мікроелектродну техніку, зареєстрували потенціал дії м'язового волокна.

Використовувати скляні мікроелектроди для аплікації речовин на мембрану клітини запропонував В. Л. Настук 1953 року[6].

У СРСР мікроелектродну техніку ввів до практики Платон Григорович Костюк[7][8]. На Біологічному факультеті МГУ Р. А. Курелла застосував у своїй праці одночасно мікроелектродну техніку та мініатюрні скляні іонометричні електроди для досліджень субклітинних структур[уточнити][9].

Конструкція і виготовлення[ред. | ред. код]

Матеріалом для виготовлення мікроелектродів слугує скляний капіляр діаметром близько 1 мм. Зазвичай використовують марку скла «Пірекс», рідше застосовують інші типи скла — алюмосилікатні 38-ЗС і кварцове скло. Часто як заготівлі беруть капіляр з вплавленними всередину нього скляними нитками — в такому разі надалі полегшується заповнення мікроелектроди електролітом. Заготівлі ретельно очищають.

Приготування мікропіпетки[ред. | ред. код]

Скляний мікроелектрод виготовляється витягуванням і розривом нагрітого капіляра на спеціальному пристосуванні — пуллері (мікрокузні). Параметри отримуваного мікроелектроду залежать від обраного ґатунку скла, діаметра капіляру, температури нагріву, моменту початку ривка і його сили.[1] Найдосконаліші моделі сучасних пуллерів з мікропроцесорним управлінням дозволяють програмувати різні форми кінчика витягувальної мікропіпетки[10], забезпечуючи заздалегідь задані властивості й гарну їх повторюваність.

Циліндрична частина отриманої заготівлі плавно звужується, переходячи до колючої частини. Витягнуті мікропіпетки оглядаються під мікроскопом, при діаметрі колючого кінчика менше 0,5 мкм він є нерозрізнюваним, гублячись у інтерференційній облямівці. У деяких випадках кінчик мікроелектроду додатково заточують або оплавляют особливим чином.

Мікроелектроди для петч-кламп додатково покривають силіконом задля забезпечення формування гігаомного контакту при торканні мембрани клітини.

Заповнення електроду[ред. | ред. код]

Заготівлю заповнюють електролітом, найчастіше 2-3 М розчином хлориду калію. Іноді використовують електроліти іншого складу або заповнюють електрод легкоплавким металом, наприклад, сплавом Вуда[11].

Заповнення електродів може бути утруднене через замалий діаметр його робочої частини. Для його полегшення запропоновано ряд методик: заповнення у вакуумі, попереднє заповнення спиртом і потім витіснення спирту електролітом[12]. Наразі широко застосовується запропонований Тасакі[en][13] метод з використанням вбудованого у мікропіпетку скляного волокна, при цьому мікроелектрод заповнюється під дією капілярних сил[14].

Підключення та контроль[ред. | ред. код]

Для підключення електродів до вимірювальної апаратурі їх фіксують у заповненому електролітом цанговому тримачі або вводять у циліндричну частину заповненого електрода хлорований срібний дріт.

Якість заповненого і підключеного мікроелектрода контролюють, вимірюючи його опір, який має порядок одиниць мегаом. Менший опір свідчить про те, що кінчик мікроелектроду обламаний, більший або хаотично змінюваний — про забитість колючого кінчика брудом.

Готові мікроелектроди погано зберігаються, тому виготовляють їх звичайно безпосередньо перед початком експерименту[15]. Деякий час, не більше доби, їх можна зберігати в холодильнику, зануривши у склянку з електролітом. При тривалому зберіганні електроди втрачають придатність через кристалізацію електроліту, можливо заростання їх колоніями мікроорганізмів[16].

Фізико-хімічні властивості мікроелектродів[ред. | ред. код]

Між мікроелектродом і середовищем, у яке він занурений (фізіологічним розчином, клітинним вмістом), протікають різні фізико-хімічні процеси.

  • Дифузія. Концентрація електроліту в мікроелектроді вище, ніж у навколишньому його середовищі, тому речовини електроліту переходитимуть у фізіологічний розчин або всередину клітини за рахунок дифузії[17][Пр. 1].
  • Іонофорез
  • Електроосмос
  • Гідростатичні процеси

Електричні властивості мікроелектродів[ред. | ред. код]

Електричний опір — найважливіший параметр мікроелектроду. Опір обов'язково контролюється перед початком експерименту, а в низці випадків — і в ході роботи. Для придатного електрода опір знаходиться в діапазоні поміж 5 і 20 МОм. Опір менше 1 МОм — ознака обламаної колючої частини, понад 60 МОм — кінчик електроду занадто тонкий, або закоркований кристалами, що випали, або частками досліджуваного об'єкта[18]. Хаотично змінюваний опір також характерний для забрудненого електроду. Електроди з високим опором мають великі власні шуми та чутливість до електромагнітних перешкод. При струмах, що перевищують 1, вольт-амперні характеристики мікроелектродів можуть ставати нелінійними. Розрахунок опору електродів можливий, але він складний і не дає високої точності, тому на практиці опір електрода визначають експериментально[19].

Ємність електрода. Наявність у мікроелектрода власної ємності спотворює форму реєстрованого сигналу. Тому докладаються зусилля для її зниження та компенсації: збільшують діаметр циліндричної частини електроду, зменшують його довжину, для підключення до підсилювача намагаються використовувати якомога коротші проводи. Для компенсація ємності електрода у вхідному каскаді підсилювача використовується ємнісний негативний зворотний зв'язок. Компенсування ємності контролюється поданням на електрод прямокутного сигналу — при вірному налаштуванні форма його фронту не спотворена[20].

Потенціал зсуву. Виникає з кількох причин. Основними є:

  • дифузійний потенціал — виникає між електролітом, що заповнює електрод, і розчином, до якого він занурений. Для зменшення дифузійного потенціалу, використовують розчин хлориду калію як електроліт, бо у іонів K+ і Cl- однаковий заряд і близькі коефіцієнти дифузії.
  • потенціал між срібними провідниками мікроелектрода й опорного електроду
  • потенціал колючої частини. Його виникнення пов'язане з властивостями контакту електроліту і скла у вузькому кінчику мікропіпетки[21].

Потенціал зсуву, підключеного до підсилювача і зануреного у фізіологічний розчин електрода, компенсується при регулюванні підсилювача.

Для зменшення небажаного власного потенціалу використовують наступні прийоми[22]:

  • ретельне очищення скляних заготівель промиванням у лугу і спирті;
  • використання свіжовиготовлених мікропіпеток;
  • використання для заповнення електролітів високої концентрації;
  • підкислення електроліту;
  • відбір електродів з малим омічним опором;
  • відбір електродів з низьким власним потенціалом.

Типи мікроелектродів[ред. | ред. код]

Багатоканальні мікроелектроди[ред. | ред. код]

Багатоканальні мікроелектроди часто використовуються в дослідженнях зі застосуванням іонофорезу (мікроелектрофореза). Вони дозволяють проводити одночасно реєстрацію електричної активності й вводити активні речовини з сусідніх стовбурів мікропіпетки. Зазвичай число каналів такого складного електрода не менше трьох: один слугує для реєстрації, другий — для компенсації та контролю ефектів струму, і третій — для введення досліджуваної речовини[23].

Окремі канали можуть розташовуватися паралельно один одному або коаксіально.

Велику паразитну ємність багатоканальних мікроелектродів іноді компенсують за рахунок створення струмопровідного екрану шляхом напилення на його неробочу частину металу або графіту[23].

Для заповнення багатоканальних мікроелектродів електролітом і розчинами досліджуваних речовин може застосовуватися центрифугування.

Підготовка багатоканальних мікроелектродів технічно складна; висловлювалася думка, що їх виготовлення є настільки ж мистецтвом, наскільки і наукою[24].

Складові мікроелектроди[ред. | ред. код]

Використовують для тих же цілей, що і багатоканальні. Складові мікроелектроди сильніше травмують клітку, однак за своїми електричними характеристиками часто перевершують багатоканальні. Збирають із окремих мікроелектродів, контролюючи роботу під мікроскопом.

Плавучий мікроелектрод[ред. | ред. код]

Для реєстрації електричної активності клітин скорочувальних тканин, наприклад, міокарда, використовують плавучі мікроелектроди, запропоновані Вудбері і Бреді[25]. Вони мають полегшену конструкцію, з дуже короткою циліндричною частиною і закріплюються на тонкому срібному або вольфрамовому дроті краплею лаку. Мікроманіпулятором електрод підводиться до поверхні тканини і опускається на неї. Вколюється у тканину він під дією власної ваги; при попаданні електрода в клітину відзначається стрибок напруги.

За рахунок пружності дроту електрод може рухатися разом з тканиною, в яку він уколотий. На практиці, вдається утримувати електрод у клітині протягом декількох хвилин.

Мікропіпетки для patch-clamp[ред. | ред. код]

Докладніше: Метод локальної фіксації потенціалу

Підсилювачі для роботи зі скляними мікроелектродами[ред. | ред. код]

Докладніше: Підсилювач біопотенціалів

Підсилювачі біопотенціалів, що використовуються зі скляними мікроелектродами, повинні володіти наступними характеристиками[26]:

  • наявність схеми компенсації ємності вхідного ланцюга;
  • діапазон вхідних напруг ± 1В;
  • регулювання зміщення ± 300 мВ;
  • струми витоку менше 14 пА;
  • час наростання фронту сигналу — не більше 100 мс;
  • температурний дрейф — менше 50 мкВ.

Для роботи методом patch-clamp використовуються спеціалізовані підсилювачі.

Див. також[ред. | ред. код]

Посилання[ред. | ред. код]

  1. ↑ а б Камкин, 2011, с. 26.
  2. ↑ (англ.) Hamill O.P., Marty F., Neher E. et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cell and cekk-free membrane patches // Europ. J. Physiok. — 1981. — Vol. 391 (2) p.85 — 100.
  3. ↑ Кожечкин, 1975, с. 63.
  4. ↑ (англ.) 1949, G. Ling & R.W. Gerard, The normal membrane potential of frog sartorius fibers, in: J. Cell. Comp. Physiol., 34, p. 383-96.
  5. ↑ (англ.) Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). «The electrical activity of single muscle fibers». J. Cell. Comp. Physiol. 35: 39-73
  6. ↑ Nastuk W. L. The Electrical Activity of the Muscle Cell Membrane at the Neuro-muscular Jumction — J. Cellular Comp. Physiol. — v. 42, p.249-272, 1953
  7. ↑ (рос.) Стеклянный микроэлектрод — стаття з Великої радянської енциклопедії.
  8. ↑ (рос.) Брежестовский П. Миссионер в науке — газета «Троицкий вариант — Наука» — № 10 (54), 25.10.2010 [1] [Архівовано 28 липня 2012 у Wayback Machine.]
  9. ↑ (рос.) Об исследованиях Г. А. Куреллы и Литвина Ф. Ф. — Кондрашин А. А., Самуилов В. Д. Солнце — энергия — жизнь. // Теория эволюции как она есть.
  10. ↑ [2] [Архівовано 2018-02-13 у Wayback Machine.] Warner Instruments PMP-102 — пуллер з мікропроцесорним управлінням.
  11. ↑ (англ.) Shanes A. M. — Electrochemical Aspects of Physiological and Pharmacological Action in Excitable Cells — Pharmacol. Revs., v.10, p.59-164, 1958
  12. ↑ (рос.) Гоффман Б., Крейнфилд П. Электрофизиология сердца. — Перевод с англ. Цузмер Е. С. под ред. Бабского Е. Б. — М.: Изд-во иностранной литературы — 1962
  13. ↑ (англ.) Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner M. J., Yu W. Y. A simple, direct and rapid method for filling microelectrodes. — Physiol. Behav., 1968, v.3, p. 1009—1010.
  14. ↑ Камкин, 2007.
  15. ↑ (рос.) Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. Г. Камкин и др. М.:Изд. центр «Академия» 2007.
  16. ↑ Кожечкин, 1975, с. 82.
  17. ↑ Камкин, 1989, с. 108.
  18. ↑ Камкин, 2011, с. 32.
  19. ↑ Камкин, 1989, с. 112.
  20. ↑ Камкин, 2011, с. 33.
  21. ↑ Камкин, 2011, с. 34.
  22. ↑ Кожечкин, 1975, с. 76.
  23. ↑ а б (рос.) Александров А. А. Метод микроэлектрофореза в физиологии. — Л.: Наука, 1983. — 148 с. — (Методы физиологических исследований).
  24. ↑ (англ.) Kelly J. S. Microiontophoretic application of drugs onto single neurons. — In: Handbook of psychopharvacology. New York; London, 1975, v.2, p. 29-67
  25. ↑ (англ.) Woodbury J.W., Brady A.J Intracellular recording from Moving Tissues with a Flexibly Mounted Microelectrode — Science, 123, p. 100—101, 1956
  26. ↑ Камкин, 2011, с. 43.

Примітки[ред. | ред. код]

  1. ↑ З деякими спрощеннями, швидкість дифузії (моль/с) можна оцінити таким чином: , де  — концентрація електроліту,  — коефіцієнт дифузії,  — половина внутрішнього кута кінчика електроду, постійного для цього типу електродів,  — внутрішній радіус колючого кінчика. Тобто, швидкість дифузії прямо пропорційна товщині колючого кінчика і концентрації електроліту, що заповнює мікроелектрод.

Література[ред. | ред. код]

  • (рос.) Камкин А. Г., Киселёва И. С. Техническое обеспечение микроэлектродного исследования клеток / под ред. И. С. Киселёвой. — Москва : 2 МГОЛМИ им. Н. И. Пирогова, 1989. — 174 с. — 1000 экз. прим.
  • (рос.) Камкин А. Г. и др. Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. — Москва : Изд. центр «Академия», 2007. — ISBN 978-5-7695-2723-4.
  • (рос.) Фізіологія: керівництво до експериментальних робіт: навч. допомога = Физиология: руководство к экспериментальным работам: учеб. пособие / под ред. Камкина Г. А., Киселёвой И. С. — Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 384 с. — ISBN 978-5-9704-1777-5.
  • (рос.) Кожечкин С. Н. Микроэлектроды // Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток / под ред. Вепринцев Б. Н., Крастс И. В. — Пущино : Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1975. — 800 прим.
  • (укр.) Костюк П. Г. Мікроелектродна техніка. — Київ : «Наукова Думка», 1960.
  • (рос.) Пёрвис Р. Микроэлектродные методы внутриклеточной регистрации и ионофореза: Пер. с англ = Microelectrode methods for intracellular recording and ionophoresis - R. D. Purves. — Москва : «Мир», 1983. — 208 с. — 2300 прим.
Отримано з https://uk.wikipedia.org/w/index.php?title=Скляний_мікроелектрод&oldid=38260745