Скляний мікроелектрод
- У цього терміну існують і інші значення, див. Електрод (значення)
Скляни́й мікроелектро́д — дуже тонка скляна піпетка, заповнена електролітом. Використовується в електрофізіології. Розроблення мікроелектродних методів дозволило вести електрофізіологічні дослідження на рівні окремих клітин.
Діаметр кінчику скляного мікроелектрода близько 0,5 мкм, іноді — менше 0,1 мкм[1], при розгляданні в оптичний мікроскоп він може бути невиразний.
Не слід плутати цей інструмент зі субтильними моделями іонометричних скляних електродів, що, зокрема, також використовуються в електрофізіології.
Існують три основні способи використання мікроелектродів:
- для внутрішньоклітинної реєстрації електричних параметрів клітинних мембран,
- для поляризації клітинних мембран електричним струмом,
- для введення різних речовин усередину клітини (іонофорез) або подання їх на її поверхню (аплікація).
Подальшим розвитком мікроелектродної техніки став метод локальної фіксації потенціалу (метод patch-clamp)[2]. Розроблені для цього методу спеціальні типи мікроелектродів зазвичай називають мікропіпетками. Чутливість методу дозволяє реєструвати активність окремих іонних каналів клітинної мембрани.
До розроблення скляних мікроелектродів у фізіології використовувалися металеві електроди, наприклад, з вольфрамового дроту, заточеного електрохімічно[3]. Малий електричний опір металевих електродів дозволяв використовувати з ними примітивну реєструвальну апаратуру з малим вхідним опором. У деяких галузях такі електроди застосовуються і донині.
Уперше скляні мікроелектроди застосували 1949 року[4] Р. Лінґ і Р. В. Джерард[en] у своїй роботі з реєстрації мембранного потенціалу міоцитів жаби.
В. Л. Настук і А. Л. Годжкін 1950 року, використовуючи[5] мікроелектродну техніку, зареєстрували потенціал дії м'язового волокна.
Використовувати скляні мікроелектроди для аплікації речовин на мембрану клітини запропонував В. Л. Настук 1953 року[6].
У СРСР мікроелектродну техніку ввів до практики Платон Григорович Костюк[7][8]. На Біологічному факультеті МГУ Р. А. Курелла застосував у своїй праці одночасно мікроелектродну техніку та мініатюрні скляні іонометричні електроди для досліджень субклітинних структур[уточнити][9].
Матеріалом для виготовлення мікроелектродів слугує скляний капіляр діаметром близько 1 мм. Зазвичай використовують марку скла «Пірекс», рідше застосовують інші типи скла — алюмосилікатні 38-ЗС і кварцове скло. Часто як заготівлі беруть капіляр з вплавленними всередину нього скляними нитками — в такому разі надалі полегшується заповнення мікроелектроди електролітом. Заготівлі ретельно очищають.
Скляний мікроелектрод виготовляється витягуванням і розривом нагрітого капіляра на спеціальному пристосуванні — пуллері (мікрокузні). Параметри отримуваного мікроелектроду залежать від обраного ґатунку скла, діаметра капіляру, температури нагріву, моменту початку ривка і його сили.[1] Найдосконаліші моделі сучасних пуллерів з мікропроцесорним управлінням дозволяють програмувати різні форми кінчика витягувальної мікропіпетки[10], забезпечуючи заздалегідь задані властивості й гарну їх повторюваність.
Циліндрична частина отриманої заготівлі плавно звужується, переходячи до колючої частини. Витягнуті мікропіпетки оглядаються під мікроскопом, при діаметрі колючого кінчика менше 0,5 мкм він є нерозрізнюваним, гублячись у інтерференційній облямівці. У деяких випадках кінчик мікроелектроду додатково заточують або оплавляют особливим чином.
Мікроелектроди для петч-кламп додатково покривають силіконом задля забезпечення формування гігаомного контакту при торканні мембрани клітини.
Заготівлю заповнюють електролітом, найчастіше 2-3 М розчином хлориду калію. Іноді використовують електроліти іншого складу або заповнюють електрод легкоплавким металом, наприклад, сплавом Вуда[11].
Заповнення електродів може бути утруднене через замалий діаметр його робочої частини. Для його полегшення запропоновано ряд методик: заповнення у вакуумі, попереднє заповнення спиртом і потім витіснення спирту електролітом[12]. Наразі широко застосовується запропонований Тасакі[en][13] метод з використанням вбудованого у мікропіпетку скляного волокна, при цьому мікроелектрод заповнюється під дією капілярних сил[14].
Для підключення електродів до вимірювальної апаратурі їх фіксують у заповненому електролітом цанговому тримачі або вводять у циліндричну частину заповненого електрода хлорований срібний дріт.
Якість заповненого і підключеного мікроелектрода контролюють, вимірюючи його опір, який має порядок одиниць мегаом. Менший опір свідчить про те, що кінчик мікроелектроду обламаний, більший або хаотично змінюваний — про забитість колючого кінчика брудом.
Готові мікроелектроди погано зберігаються, тому виготовляють їх звичайно безпосередньо перед початком експерименту[15]. Деякий час, не більше доби, їх можна зберігати в холодильнику, зануривши у склянку з електролітом. При тривалому зберіганні електроди втрачають придатність через кристалізацію електроліту, можливо заростання їх колоніями мікроорганізмів[16].
Між мікроелектродом і середовищем, у яке він занурений (фізіологічним розчином, клітинним вмістом), протікають різні фізико-хімічні процеси.
- Дифузія. Концентрація електроліту в мікроелектроді вище, ніж у навколишньому його середовищі, тому речовини електроліту переходитимуть у фізіологічний розчин або всередину клітини за рахунок дифузії[17][Пр. 1].
- Іонофорез
- Електроосмос
- Гідростатичні процеси
Електричний опір — найважливіший параметр мікроелектроду. Опір обов'язково контролюється перед початком експерименту, а в низці випадків — і в ході роботи. Для придатного електрода опір знаходиться в діапазоні поміж 5 і 20 МОм. Опір менше 1 МОм — ознака обламаної колючої частини, понад 60 МОм — кінчик електроду занадто тонкий, або закоркований кристалами, що випали, або частками досліджуваного об'єкта[18]. Хаотично змінюваний опір також характерний для забрудненого електроду. Електроди з високим опором мають великі власні шуми та чутливість до електромагнітних перешкод. При струмах, що перевищують 1, вольт-амперні характеристики мікроелектродів можуть ставати нелінійними. Розрахунок опору електродів можливий, але він складний і не дає високої точності, тому на практиці опір електрода визначають експериментально[19].
Ємність електрода. Наявність у мікроелектрода власної ємності спотворює форму реєстрованого сигналу. Тому докладаються зусилля для її зниження та компенсації: збільшують діаметр циліндричної частини електроду, зменшують його довжину, для підключення до підсилювача намагаються використовувати якомога коротші проводи. Для компенсація ємності електрода у вхідному каскаді підсилювача використовується ємнісний негативний зворотний зв'язок. Компенсування ємності контролюється поданням на електрод прямокутного сигналу — при вірному налаштуванні форма його фронту не спотворена[20].
Потенціал зсуву. Виникає з кількох причин. Основними є:
- дифузійний потенціал — виникає між електролітом, що заповнює електрод, і розчином, до якого він занурений. Для зменшення дифузійного потенціалу, використовують розчин хлориду калію як електроліт, бо у іонів K+ і Cl- однаковий заряд і близькі коефіцієнти дифузії.
- потенціал між срібними провідниками мікроелектрода й опорного електроду
- потенціал колючої частини. Його виникнення пов'язане з властивостями контакту електроліту і скла у вузькому кінчику мікропіпетки[21].
Потенціал зсуву, підключеного до підсилювача і зануреного у фізіологічний розчин електрода, компенсується при регулюванні підсилювача.
Для зменшення небажаного власного потенціалу використовують наступні прийоми[22]:
- ретельне очищення скляних заготівель промиванням у лугу і спирті;
- використання свіжовиготовлених мікропіпеток;
- використання для заповнення електролітів високої концентрації;
- підкислення електроліту;
- відбір електродів з малим омічним опором;
- відбір електродів з низьким власним потенціалом.
Багатоканальні мікроелектроди часто використовуються в дослідженнях зі застосуванням іонофорезу (мікроелектрофореза). Вони дозволяють проводити одночасно реєстрацію електричної активності й вводити активні речовини з сусідніх стовбурів мікропіпетки. Зазвичай число каналів такого складного електрода не менше трьох: один слугує для реєстрації, другий — для компенсації та контролю ефектів струму, і третій — для введення досліджуваної речовини[23].
Окремі канали можуть розташовуватися паралельно один одному або коаксіально.
Велику паразитну ємність багатоканальних мікроелектродів іноді компенсують за рахунок створення струмопровідного екрану шляхом напилення на його неробочу частину металу або графіту[23].
Для заповнення багатоканальних мікроелектродів електролітом і розчинами досліджуваних речовин може застосовуватися центрифугування.
Підготовка багатоканальних мікроелектродів технічно складна; висловлювалася думка, що їх виготовлення є настільки ж мистецтвом, наскільки і наукою[24].
Використовують для тих же цілей, що і багатоканальні. Складові мікроелектроди сильніше травмують клітку, однак за своїми електричними характеристиками часто перевершують багатоканальні. Збирають із окремих мікроелектродів, контролюючи роботу під мікроскопом.
Для реєстрації електричної активності клітин скорочувальних тканин, наприклад, міокарда, використовують плавучі мікроелектроди, запропоновані Вудбері і Бреді[25]. Вони мають полегшену конструкцію, з дуже короткою циліндричною частиною і закріплюються на тонкому срібному або вольфрамовому дроті краплею лаку. Мікроманіпулятором електрод підводиться до поверхні тканини і опускається на неї. Вколюється у тканину він під дією власної ваги; при попаданні електрода в клітину відзначається стрибок напруги.
За рахунок пружності дроту електрод може рухатися разом з тканиною, в яку він уколотий. На практиці, вдається утримувати електрод у клітині протягом декількох хвилин.
Підсилювачі біопотенціалів, що використовуються зі скляними мікроелектродами, повинні володіти наступними характеристиками[26]:
- наявність схеми компенсації ємності вхідного ланцюга;
- діапазон вхідних напруг ± 1В;
- регулювання зміщення ± 300 мВ;
- струми витоку менше 14 пА;
- час наростання фронту сигналу — не більше 100 мс;
- температурний дрейф — менше 50 мкВ.
Для роботи методом patch-clamp використовуються спеціалізовані підсилювачі.
- ↑ а б Камкин, 2011, с. 26.
- ↑ (англ.) Hamill O.P., Marty F., Neher E. et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cell and cekk-free membrane patches // Europ. J. Physiok. — 1981. — Vol. 391 (2) p.85 — 100.
- ↑ Кожечкин, 1975, с. 63.
- ↑ (англ.) 1949, G. Ling & R.W. Gerard, The normal membrane potential of frog sartorius fibers, in: J. Cell. Comp. Physiol., 34, p. 383-96.
- ↑ (англ.) Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). «The electrical activity of single muscle fibers». J. Cell. Comp. Physiol. 35: 39-73
- ↑ Nastuk W. L. The Electrical Activity of the Muscle Cell Membrane at the Neuro-muscular Jumction — J. Cellular Comp. Physiol. — v. 42, p.249-272, 1953
- ↑ (рос.) Стеклянный микроэлектрод — стаття з Великої радянської енциклопедії.
- ↑ (рос.) Брежестовский П. Миссионер в науке — газета «Троицкий вариант — Наука» — № 10 (54), 25.10.2010 [1] [Архівовано 28 липня 2012 у Wayback Machine.]
- ↑ (рос.) Об исследованиях Г. А. Куреллы и Литвина Ф. Ф. — Кондрашин А. А., Самуилов В. Д. Солнце — энергия — жизнь. // Теория эволюции как она есть.
- ↑ [2] [Архівовано 2018-02-13 у Wayback Machine.] Warner Instruments PMP-102 — пуллер з мікропроцесорним управлінням.
- ↑ (англ.) Shanes A. M. — Electrochemical Aspects of Physiological and Pharmacological Action in Excitable Cells — Pharmacol. Revs., v.10, p.59-164, 1958
- ↑ (рос.) Гоффман Б., Крейнфилд П. Электрофизиология сердца. — Перевод с англ. Цузмер Е. С. под ред. Бабского Е. Б. — М.: Изд-во иностранной литературы — 1962
- ↑ (англ.) Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner M. J., Yu W. Y. A simple, direct and rapid method for filling microelectrodes. — Physiol. Behav., 1968, v.3, p. 1009—1010.
- ↑ Камкин, 2007.
- ↑ (рос.) Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. Г. Камкин и др. М.:Изд. центр «Академия» 2007.
- ↑ Кожечкин, 1975, с. 82.
- ↑ Камкин, 1989, с. 108.
- ↑ Камкин, 2011, с. 32.
- ↑ Камкин, 1989, с. 112.
- ↑ Камкин, 2011, с. 33.
- ↑ Камкин, 2011, с. 34.
- ↑ Кожечкин, 1975, с. 76.
- ↑ а б (рос.) Александров А. А. Метод микроэлектрофореза в физиологии. — Л.: Наука, 1983. — 148 с. — (Методы физиологических исследований).
- ↑ (англ.) Kelly J. S. Microiontophoretic application of drugs onto single neurons. — In: Handbook of psychopharvacology. New York; London, 1975, v.2, p. 29-67
- ↑ (англ.) Woodbury J.W., Brady A.J Intracellular recording from Moving Tissues with a Flexibly Mounted Microelectrode — Science, 123, p. 100—101, 1956
- ↑ Камкин, 2011, с. 43.
- ↑ З деякими спрощеннями, швидкість дифузії (моль/с) можна оцінити таким чином: , де — концентрація електроліту, — коефіцієнт дифузії, — половина внутрішнього кута кінчика електроду, постійного для цього типу електродів, — внутрішній радіус колючого кінчика. Тобто, швидкість дифузії прямо пропорційна товщині колючого кінчика і концентрації електроліту, що заповнює мікроелектрод.
- (рос.) Камкин А. Г., Киселёва И. С. Техническое обеспечение микроэлектродного исследования клеток / под ред. И. С. Киселёвой. — Москва : 2 МГОЛМИ им. Н. И. Пирогова, 1989. — 174 с. — 1000 экз. прим.
- (рос.) Камкин А. Г. и др. Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. — Москва : Изд. центр «Академия», 2007. — ISBN 978-5-7695-2723-4.
- (рос.) Фізіологія: керівництво до експериментальних робіт: навч. допомога = Физиология: руководство к экспериментальным работам: учеб. пособие / под ред. Камкина Г. А., Киселёвой И. С. — Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 384 с. — ISBN 978-5-9704-1777-5.
- (рос.) Кожечкин С. Н. Микроэлектроды // Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток / под ред. Вепринцев Б. Н., Крастс И. В. — Пущино : Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1975. — 800 прим.
- (укр.) Костюк П. Г. Мікроелектродна техніка. — Київ : «Наукова Думка», 1960.
- (рос.) Пёрвис Р. Микроэлектродные методы внутриклеточной регистрации и ионофореза: Пер. с англ = Microelectrode methods for intracellular recording and ionophoresis - R. D. Purves. — Москва : «Мир», 1983. — 208 с. — 2300 прим.